堿基特異性引物結合探針熔解曲線技術檢測EGFR基因29種突變.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和死亡率一直位居各類腫瘤之首，而非小細胞肺癌約占肺癌總數的85％。吉非替尼和埃羅替尼是近年來開發(fā)的兩種特異性較高的治療非小細胞肺癌的靶向治療藥物，它們都屬于表面生長因子受體(EGFR)——酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物。然而，臨床實踐顯示這兩種藥物的療效存在很大的個體差異，僅對10％～30％的非小細胞肺癌患者有較好的療效。研究發(fā)現，EGFR基因酪氨酸激酶區(qū)域存在著多種突變，這些突變會對EGFR-TKI類藥物的療效有顯著影響

2、。
　　 腫瘤體細胞突變存在于大量的野生型背景之中，對檢測技術的要求較高。本論文以實時熒光PCR為平臺，使用堿基特異性引物結合探針熔解曲線分析的方法建立了檢測29種EGFR突變的五管雙色體系。該體系通過堿基特異性引物選擇性地擴增突變模板，使用特異熒光探針抑制野生型的擴增，并利用熔解曲線熔解峰的Tm值對突變進行區(qū)分。
　　 為防止擴增產物污染，我們在體系中加入了dUTP和UNG酶。建立好的UNG/dUTP防污染體系可將含有

3、dUTP模板的濃度降低10～100倍。檢測體系可耐受200ng的野生型細胞系基因組，可檢出低至30拷貝(0.1ng)的突變模板，且可檢出100ngDNA樣品中含量低至0.5％的突變。
　　 我們利用建立的體系對臨床標本進行了檢測:其中正常人血液和絨毛膜標本40份，結果全部為陰性，無非特異出現;2011～2012年FFPE肺癌標本100份，檢出陽性標本27份，與測序結果對比一致性較好，Kappa值為0.974，p＜0.05;中山醫(yī)