高分辨探針熔解曲線快速檢測耐藥結(jié)構(gòu)分枝桿菌的研究.pdf

1、研究背景：
　　 結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的疾病，它流行于世界各國家與地區(qū)，在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)情況尤甚。由于結(jié)核病病程長、患者依從性差，加上抗結(jié)核藥物的不當使用，使MTB出現(xiàn)了耐藥性問題并逐漸加劇，導致結(jié)核病近年來又重新成為受到廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的診斷方法如痰涂片、藥敏試驗的檢出率低，周期長，因此快速檢測與診斷耐藥結(jié)核就成為了結(jié)核病防治的重要攻關(guān)方向。

2、研究證實MTB耐藥的主要原因是菌株的基因變異，耐利福平(Rifampicin，RFP)突變主要位于rpoB基因中的81bp片段，耐異煙肼(Isoniazid，INH)突變主要位于katG315、inhA啟動子、ahpC啟動子、inhA94等位點。高分辨熔解曲線分析(High-resolution melting，HRM)是近年出現(xiàn)的一種應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)分析的技術(shù)，

3、是一種操作簡便、快速、低成本、結(jié)果準確，并實現(xiàn)了真正的閉管操作的檢測方法。在本研究中，我們將HRM應(yīng)用于MTB的耐藥相關(guān)基因katG、inhA、ahpC、rpoB的檢測。
　　 目的：
　　 通過HRM與基因測序分別檢測MTB耐藥基因katG、inhA、ahpC啟動子區(qū)域和rpoB81bp核心區(qū)域的結(jié)果對比研究，探討HRM快速檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的異煙肼與利福平耐藥突變位點的可行性。
　　 方法：
　　

4、1.使用改良羅氏中性培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種菌株，對所培養(yǎng)的菌株進行INH與RFP的藥物敏感性測定。
　　 2.將所有312株菌株進行katG、inhA、ahpC、rpoB基因目的片段的測序，運用blastn進行序列比對和分析。
　　 3.通過建立HRM方法，檢測140株RFP耐藥株rpoB中的81bp片段、150株INH耐藥株katG315位、inhA啟動子區(qū)、inhA94位、ahpC啟動子區(qū)與rpoB81bp核心區(qū)域，并與基因測序

5、結(jié)果相比較，驗證HRM在耐藥結(jié)核分枝桿菌快速檢測中的可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1.RFP與INH基因測序的突變率分別為95.7％(134/140)、92％(138/150)。HRM檢測RFP與INH的突變率分別為95.7％(134/140)，88.1％(133/150)?；驕y序與HRM檢測結(jié)果差別無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　 2.140例RFP耐藥株HRM檢測與基因測序的陽性符合率為97.8％(13

6、1/134)，150株INH耐藥株中HRM檢測與基因測序的陽性符合率為96.4％(133/138)
　　 3.HRM方法檢測RFP的特異度為98.0％(150/153)，靈敏度為93.6％(134/140)，INH檢測的特異度為98.7％(151/153)，靈敏度為88.1％(133/150)。
　　 結(jié)論：
　　 1.與基因測序相比，HRM檢測在應(yīng)用于耐藥MTB的快速檢測時有同樣的陽性檢出能力，但更加簡便、快速