利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)快速檢測鑒定四種臨床常見侵襲性曲霉菌的方法學(xué)研究.pdf

1、侵襲性真菌感染是免疫力低下病人不得不面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近些年，腫瘤，艾滋病，器官移植等免疫低下病人的侵襲性真菌感染率不斷上升，且死亡率極高。臨床上侵襲性真菌感染的常見病原多為念珠菌屬，但隱球菌尤其是新生隱球菌，絲狀真菌尤其是曲霉菌屬等條件致病性真菌感染的發(fā)生近年來也呈逐年上升趨勢。對于這些感染的臨床治療而言，治療效果很大程度上取決于病人的免疫力狀況及能否及時給與準(zhǔn)確有效的抗真菌藥物。目前臨床上常用的抗真菌藥物主要有兩性霉素B，酮康唑，氟康

2、唑，泊沙康唑、卡泊芬凈等。有文獻(xiàn)報道，臨床上分離到越來越多的對唑類抗真菌藥物和兩性霉素B耐藥的曲霉菌株，因此有必要研究一種能夠快速檢測鑒定臨床常見曲霉菌的方法，為臨床進(jìn)行更有效的侵襲性曲霉菌感染治療提供參考。
　　 高分辨熔解曲線分析技術(shù)的基本原理是在PCR完成后，升高PCR體系溫度，利用雙鏈DNA飽和熒光染料，實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA飽和熒光染料與體系中DNA雙鏈的結(jié)合情況（儀器上反映為熒光信號的變化），達(dá)到DNA雙鏈序列

3、分析的目的。雙鏈DNA飽和熒光染料的結(jié)合原理與傳統(tǒng)的熒光定量PCR染料不同。傳統(tǒng)的熒光染料如SybrGreen等屬于不飽和熒光染料，體系中此種熒光染料存在對PCR反應(yīng)有抑制作用，因此在體系中加入的不飽和熒光染料濃度很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于產(chǎn)物DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中染料結(jié)合位點的數(shù)目，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中存在大量的空余熒光染料結(jié)合位點。PCR過程完成產(chǎn)生大量的產(chǎn)物DNA雙鏈，熒光染料分子結(jié)合在產(chǎn)物DNA雙鏈上的染料結(jié)合位點。隨著體系溫度逐漸升高，體系中的DN

4、A雙鏈開始變性解鏈，熒光染料分子逐漸離開DNA雙鏈結(jié)合位點，反映為熒光信號的逐漸降低。SybrGreen等不飽和熒光染料分子在離開DNA雙鏈的過程中會發(fā)生分子結(jié)合位置的重排，因DNA解鏈而離開的不飽和熒光染料分子會迅速重新結(jié)合到尚未解鏈的其他雙鏈部分上空余染料結(jié)合位點，熒光信號的變化失真，不能準(zhǔn)確反映體系內(nèi)DNA雙鏈的解鏈情況。而飽和熒光染料如LCGreen等對PCR反應(yīng)基本無抑制作用，PCR體系中熒光染料的添加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體系中DNA雙

5、鏈上的染料結(jié)合位點數(shù)目，DNA雙鏈上不會存在空余的染料結(jié)合位點，解鏈過程中能夠最大程度上減少染料分子重排。體系溫度升高，體系中DNA雙鏈變性解鏈，飽和熒光染料分子與解鏈的DNA雙鏈解離，因其他尚未解鏈的DNA雙鏈上不存在空余結(jié)合位點，解離的染料分子不會重新結(jié)合到雙鏈DNA上，熒光信號的變化能夠真實反映體系中雙鏈DNA的解鏈情況，使利用熔解曲線進(jìn)行序列分析成為可能。
　　 不對稱PCR擴(kuò)增技術(shù)(asymmetricPCR)顧名思義

6、，不對稱PCR方法中兩種引物的量相差懸殊，通常1:5～1:100不等，其中量相對較少的引物稱為限制引物，相對過量的引物稱為過剩引物。不對稱PCR體系在反應(yīng)的前幾十個循環(huán)中同時存在正向引物和反向引物，可以生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物，經(jīng)過15-30個循環(huán)左右，濃度相對較低的限制引物消耗完全。在PCR反應(yīng)的后面幾十個循環(huán)中，體系中僅存在過剩引物。過剩引物在體系中擴(kuò)增產(chǎn)生大量的單鏈DNA。
　　 在高分辨熔解曲線的基本分析原理和不對稱PCR

7、擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，引入非標(biāo)記探針技術(shù)，是對高分辨熔解曲線技術(shù)的一種延伸和應(yīng)用。非標(biāo)記探針是長度在20-40bp左右的3'端封閉阻止延伸的一段寡核苷酸鏈。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，非標(biāo)記探針寡核苷酸鏈只需要在探針的3'端進(jìn)行封閉阻止其在PCR過程中發(fā)生自身擴(kuò)增，而無需任何熒光基團(tuán)修飾。在PCR反應(yīng)完成后，進(jìn)行一個變性，復(fù)性的基本過程，探針結(jié)合到單鏈產(chǎn)物上，形成局部雙鏈結(jié)構(gòu)。再進(jìn)行升溫變性，采集熒光信號，在相對較低的溫度時，探針與產(chǎn)物結(jié)合形成的

8、局部雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生解鏈，反映為熒光信號降低，產(chǎn)生探針熔解峰。繼續(xù)升溫，PCR體系中產(chǎn)生的目的DNA產(chǎn)物發(fā)生熔解解鏈，熒光信號降低明顯，產(chǎn)生產(chǎn)物熔解峰。通過分析探針峰和產(chǎn)物熔解峰的熔解溫度(meltingtemperature，Tm)，使序列分析更加敏感，特異。
　　 在本研究中，我們將高分辨熔解曲線分析技術(shù)，非標(biāo)記探針技術(shù)和不對稱PCR技術(shù)引入四種臨床常見曲霉菌的檢測鑒定中，試圖探索一種快速，準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)的曲霉菌病原檢測鑒定方法。<

9、br>　　 第一部分，“高分辨熔解曲線分析通用真菌引物擴(kuò)增片段檢測鑒定四種常見曲霉菌”
　　 研究方法：
　　 查找GeneBank中公布的隱球菌屬，念珠菌屬，曲霉菌屬，青霉屬等多種臨床常見真菌及人類的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通過ClustalX軟件比對找出與人類無序列同源性的真菌保守區(qū)段。以真菌核糖體RNA基因中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)為靶基因，在5.8S和28S

10、核糖體RNA基因上設(shè)計真菌通用引物，在BLAST中比對其特異性。利用設(shè)計的真菌通用引物擴(kuò)增四種曲霉菌的ITS2段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨熔解曲線分析。
　　 選擇煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床常見多種細(xì)菌和人DNA進(jìn)行引物特異性檢測。
　　 選擇對熒光定量PCR和高分辨熔解曲線分析有較大影響的因素，如退火溫度，引物濃度，Mg2+濃度等進(jìn)行體系的優(yōu)化。
　　 以煙曲霉ITS2PCR合成產(chǎn)物構(gòu)建載

11、體克隆進(jìn)行靈敏度檢測。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒，按照1:10倍比稀釋，稀釋9個濃度梯度，在各濃度取1u(l)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、設(shè)計的引物序列PrimerF-AGCGAAATGCGATAASTARTGTG,PrimerRTCCTCCGCTTATTGATATGC，擴(kuò)增片段長度335bp。
　　 2、引物特異性檢測結(jié)果可見只有相應(yīng)的四種曲霉菌有擴(kuò)增條帶，細(xì)菌及人DNA均未擴(kuò)增。
　　

12、 3、該方法的檢測限可達(dá)10copies/ul.
　　 4、高分辨熔解曲線分析結(jié)果顯示，煙曲霉，黃曲霉，土曲霉，黑曲霉四種曲霉菌的熔解曲線形狀和Tm值差異較大。
　　 結(jié)論：
　　 此部分的研究證實，四種曲霉菌的ITS2段靶基因熔解曲線差異大，通過這種方法不需測序可以將四種曲霉菌鑒別出來。
　　 若將此方法擴(kuò)展至其他臨床病原真菌，建立臨床病原真菌的熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)庫。只需要基本的PCR引物，待測菌株DNA模板

13、，LCGreen飽和熒光染料，和能夠進(jìn)行高分辨熔解曲線分析的儀器，在熔解曲線分析完成后，將待測菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)庫中的曲線進(jìn)行比對，在一定程度上能夠?qū)⑷劢馇€標(biāo)準(zhǔn)庫中已存在熔解曲線比對標(biāo)準(zhǔn)的臨床病原真菌待測菌株快速檢測鑒定出來，具有省時、省力、省錢的特點。
　　 第二部分，“四種特異性非標(biāo)記探針結(jié)合高分辨熔解曲線檢測鑒定四種常見曲霉菌”
　　 研究方法：
　　 根據(jù)核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

14、2可變區(qū)序列設(shè)計四種曲霉菌的種特異性探針，并將探針的3'端進(jìn)行C6氨基化修飾封閉以阻止在體系中DNA聚合酶的作用下探針自身擴(kuò)增延伸。在Oligo6.0和PrimerExpress3.0軟件中評價引物與探針，在BLAST中比對探針與引物的特異性。
　　 利用第一部分中設(shè)計的通用真菌引物進(jìn)行不對稱PCR。PCR完成后，加入四種曲霉菌特異性非標(biāo)記探針，再經(jīng)過變性復(fù)性，使探針與產(chǎn)物單鏈形成局部雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)行熔解曲線分析.
　　

15、選擇對不對稱PCR體系有較大影響的退火溫度，引物濃度，引物比例，Mg2+濃度，探針濃度等因素優(yōu)化體系。退火溫度由50℃遞增至65℃，引物濃度由0.1μmol/L逐漸遞增至0.5μmol/L，上下游引物比例由1:2遞增至1:20及2:1遞增至20:1，探針濃度由0.05μmol/L遞增至0.5μmol/L，Mg2+濃度由0.5mmol/L遞增至5mmol/L進(jìn)行體系優(yōu)化。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、優(yōu)化后最終的體系組成和

16、反應(yīng)條件為:5×PrimeSTARBuffer，4μl;Mg2+，1mmol/L，dNTPMixture(各2.5mmol/L)，1.6μl;引物F，0.25μmol/L;引物R，0.05μmol/L;PrimeSTARHSDNAPolymerase,0.2μl;LCGreen染料，1μl;四種探針各0.25μmol/L。模板，1μl;及去離子水，體系總體積20μl。PCR條件:98℃，10s;60℃，10s;72℃，18s;循環(huán)數(shù)60

17、，PCR擴(kuò)增完成后進(jìn)行一個變性復(fù)性的過程以促進(jìn)探針與產(chǎn)物單鏈的結(jié)合。98℃，60s，40℃，30s。經(jīng)過變性復(fù)性過程使3'端封閉的探針與產(chǎn)物單鏈結(jié)合后，設(shè)置熔解起始溫度為55℃，結(jié)束溫度為98℃，保持溫度為53℃。
　　 2、四種曲霉菌模板相應(yīng)的非標(biāo)記探針熔解曲線分析都出現(xiàn)了兩座熔解峰。根據(jù)第一部分中四種曲霉菌真菌通用引物擴(kuò)增片段高分辨熔解曲線分析結(jié)果可知，ITS2擴(kuò)增產(chǎn)物片段的Tm值介于90°C-95°C之間，故Tm值介于90

18、°C-95°C之間的熔解峰使不對稱PCR擴(kuò)增的前幾十個循環(huán)產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物的熔解峰，即產(chǎn)物峰。根據(jù)軟件評估可知，探針的Tm值高于75°C。故圖中Tm值介于82°C-87°C之間的熔解峰為非標(biāo)記探針與不對稱PCR擴(kuò)增的后幾十個循環(huán)，濃度相對較低的下游引物耗盡時，由濃度相對較高的上游引物擴(kuò)增得到的單鏈產(chǎn)物結(jié)合形成的局部雙鏈結(jié)構(gòu)的熔解峰，即探針熔解峰。探針峰與產(chǎn)物峰之間的Tm值差異明顯。
　　 討論：
　　 由于核糖體RNA基因

19、的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2同時包含著可變區(qū)和中度保守區(qū)序列。根據(jù)GeneBank中已公布的煙曲霉，黃曲霉，土曲霉，黑曲霉菌核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2序列發(fā)現(xiàn)，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的可變區(qū)中不僅存在著種間差異，也存在著種內(nèi)序列差異，長度由1-3bp不等。飽和熒光染料高分辨熔解曲線可檢測出低至1bp的堿基差異。由于種內(nèi)序列差異的存在，使得高分辨熔解曲線的形狀和Tm值可能發(fā)生變形和移動，給鑒定帶來一定的困難。
　　 我們根據(jù)四種曲霉菌的核糖體R

20、NA基因的可變區(qū)ITS2區(qū)序列，設(shè)計了具有曲霉菌種特異性的探針，并將探針的3'端進(jìn)行C6氨基修飾阻止探針與模板結(jié)合后發(fā)生延伸。加入不同濃度的上下游引物，進(jìn)行不對稱PCR。不對稱PCR完成后，體系中存在兩種PCR產(chǎn)物，一種是在PCR過程的前幾十個循環(huán)產(chǎn)生的正常的雙鏈目的產(chǎn)物，一種則是在濃度相對較低的引物消耗完全后，由濃度相對較高的引物在PCR過程的后幾十個循環(huán)產(chǎn)生的大量單鏈產(chǎn)物。經(jīng)過變性復(fù)性過程，探針與PCR過程的后幾十個循環(huán)產(chǎn)生的大量產(chǎn)

21、物單鏈結(jié)合形成局部雙鏈結(jié)構(gòu)，探針-產(chǎn)物單鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)經(jīng)過升溫變性產(chǎn)生探針峰，而由PCR過程的前幾十個循環(huán)產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物在升溫變性過程中產(chǎn)生產(chǎn)物峰，通過分析探針峰和產(chǎn)物峰的峰形和Tm值，達(dá)到檢測鑒定四種曲霉菌的目的。利用曲霉菌的種特異性探針，分析探針與單鏈產(chǎn)物形成的雙鏈結(jié)構(gòu)熔解產(chǎn)生的探針峰，使我們不需要建立曲霉菌熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)庫就可以鑒定出曲霉菌的種屬。更重要的是，引入非標(biāo)記探針，能夠克服曲霉菌的核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2可變區(qū)種