核酸序列依賴擴(kuò)增聯(lián)合酶聯(lián)免疫試驗檢測侵襲性曲霉菌的實驗研究.pdf

1、目的：
　　侵襲性曲霉菌感染（invasive aspergillosis，IA）嚴(yán)重的威脅著免疫力低下病人的生命，早期準(zhǔn)確的診斷與治療是良好預(yù)后的關(guān)鍵。本研究擬建立核酸序列依賴擴(kuò)增聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗（NASBA-ELISA）檢測曲霉菌的方法，并結(jié)合GM試驗和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）輔助診斷侵襲性曲霉病，為其提供的最佳實驗室診斷策略。
　　方法：
　　將NASBA方法和高靈敏度的地高辛檢測系統(tǒng)相結(jié)合，以鏈酶親和素

2、包被的微孔板為反應(yīng)平臺，采用地高辛標(biāo)記 NASBA恒溫擴(kuò)增曲霉菌特異性18sRNA基因片段；并用生物素標(biāo)記的DNA探針雜交捕獲地高辛標(biāo)記的 NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物，然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體和底物進(jìn)行酶標(biāo)顯色，并對其靈敏度、特異度進(jìn)行評價。最后進(jìn)行臨床驗證：收集86例 IA高?；颊叩难鍢?biāo)本，分別用NASBA-ELISA、RT-PCR和GM試驗對其進(jìn)行檢測，比較這3種方法的性能指標(biāo)，并對各種可能的聯(lián)合診斷方案進(jìn)行比較分析，擬找到一種

3、最佳的IA實驗室診斷方案。
　　結(jié)果：
　　成功建立NASBA-ELISA檢測曲霉菌的方法，其靈敏度可達(dá)1 Cfu，特異性良好；ELISA的光密度值（OD）與霉菌孢子量的對數(shù)存在線性相關(guān)關(guān)系（y=0.278x+0.119，R2=0.887）。NASBA-ELISA、GM及RT-PCR試驗方法的靈敏度分別為80.56%、58.33%、72.22%，特異度分別為80.00%、82.00%、84.00%。在聯(lián)合診斷時，NASBA-

4、ELISA與RT-PCR串聯(lián)方案具有最完美的特異度（100%）和陽性預(yù)測值（100%）；NASBA-ELISA和 RT-PCR并聯(lián)方案則有最好的靈敏度（94.12%）與尤登指數(shù)（0.652）。
　　結(jié)論：
　　NASBA-ELISA方法可半定量檢測曲霉菌，具有敏感性高、特異性強、操作簡便的特點，適合常規(guī)實驗室開展，為侵襲性曲霉病的早期診斷提供了一條新方法。同時與其他檢測方法進(jìn)行聯(lián)合的診斷方案能夠顯著優(yōu)化診斷效能，進(jìn)一步提高臨