侵襲性曲霉菌感染實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)新技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景 近年來(lái)，隨著器官移植和血液惡性腫瘤病人數(shù)量的不斷增多，免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，重癥免疫低下患者數(shù)目呈幾何爆發(fā)趨勢(shì)。機(jī)會(huì)致病菌曲霉菌所致的感染發(fā)病不斷上升，已成為僅次于念珠菌感染的第二大深部真菌病。曲霉感染的病死率可達(dá)40％以上，晚期衰竭病人合并曲霉菌感染的病死率高達(dá)80％～100％，患者存活主要依賴于早期明確診斷和及時(shí)恰當(dāng)?shù)目拐婢委?。而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷包括真菌的培養(yǎng)、影像學(xué)診斷，不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，而且缺乏敏感性，所以探索一

2、種檢測(cè)曲霉菌快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 研究目的 在廣泛復(fù)習(xí)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)自行設(shè)計(jì)引物、探針，建立簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)的提取曲霉菌DNA的方法。以期提供適合國(guó)內(nèi)臨床需要的快速診斷曲霉菌感染的Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)化方案，為臨床診斷提供參考。對(duì)收集的臨床高度疑似曲霉菌感染病人的血標(biāo)本進(jìn)行單盲檢測(cè)，評(píng)價(jià)其臨床診斷效能。把實(shí)時(shí)熒光定量PCR與臨床常用血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，得出結(jié)論。同時(shí)

3、探討抗真菌藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，找出最適合的檢測(cè)時(shí)機(jī)，提高檢測(cè)陽(yáng)性率，指導(dǎo)臨床抽血檢驗(yàn)。 研究方法 ①熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立：在NCBI中的Genebank中查找相關(guān)菌屬及人類的18S rRNA、5.8S rRNA、28S：rRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列。通過(guò)BLAST比對(duì)找出各菌屬間特異、曲霉菌屬內(nèi)保守的基因區(qū)間。通過(guò)ABI PrimerExpress 2.0軟件設(shè)計(jì)引物、探針。建立陽(yáng)性克隆質(zhì)粒：在選定的

4、熒光探針靶基因的上下游設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度在200～300bp。用普通PCR在煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌珠基因組中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，純化產(chǎn)物，將此產(chǎn)物連接到pMD19-T vector中，得到重組克隆質(zhì)粒，送往測(cè)序。證實(shí)后用于制作實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線及陽(yáng)性對(duì)照。取標(biāo)準(zhǔn)曲霉菌菌株制成懸濁液，摸索最佳的曲霉菌DNA提取方法，并進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)、最低檢測(cè)下限及方法特異性的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法診斷效能的臨床評(píng)價(jià)：收集2006年4月至2

5、007年2月，廣州南方醫(yī)院高度疑似曲霉菌感染病例71例，標(biāo)本232份。分成5批檢測(cè)，每批隨機(jī)抽得標(biāo)本，編號(hào)，用熒光定量PCR單盲檢測(cè)，后與臨床病人信息核對(duì)，評(píng)價(jià)該方法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。同時(shí)用X<'2>檢驗(yàn)(McNcmar檢驗(yàn))與臨床常用血清學(xué)方法一曲霉菌抗原(ELISA)檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)分析抗真菌藥物使用前后患者檢測(cè)結(jié)果的改變，找出抗真菌藥物對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果影響的規(guī)律，以及其檢測(cè)結(jié)果對(duì)病人預(yù)后的

6、提示作用。 研究結(jié)果 ①熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立：成功建立熒光定量PCR檢測(cè)侵襲性曲霉菌感染的方法。針對(duì)曲霉菌rDNA基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS Ⅰ設(shè)計(jì)引物、探針。擴(kuò)增片段長(zhǎng)79bp。對(duì)構(gòu)建好的克隆質(zhì)粒測(cè)序，插入片段與預(yù)期片段序列一致，相似性達(dá)99％。陽(yáng)性克隆倍比稀釋制作熒光定量PCR的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線： Y=-0.37X+16.05，R<'2>=0.997。熒光定量PCR的重復(fù)性好，平均試驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)分別為1.89％、1.

7、56％、2.57％。平均試驗(yàn)間變異系數(shù)為3.32％、3.58％、4.50％。該方法最低檢測(cè)下限達(dá)5～10CFU/ml，對(duì)白色念珠菌、隱球菌、毛霉菌、根霉菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無(wú)非特異性擴(kuò)增。 ②實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法診斷效能的臨床評(píng)價(jià)：71個(gè)病例中確診10例，臨床診斷30例，擬診8例，非曲霉菌感染病例23例。232份標(biāo)本中熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為42.2％(98/232)。該方法的敏感度為80％～

8、87.5％，特異度為95.6％(22/23)，準(zhǔn)確度為90.1％～90.7％。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.8％～97.6％，陰性預(yù)測(cè)值為75.8％～91.7％；與曲霉菌抗原檢測(cè)比較，兩者的敏感度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.549(雙側(cè))，P>0.05)；兩者特異度比較中，P=0.021(雙側(cè))，P<0.05，特異度差異有顯著性意義，熒光定量PCR的特異度較高。③抗真菌治療對(duì)熒光定量PCR方法的影響及意義：臨床上抗真菌治療對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果有較大影

9、響。臨床經(jīng)驗(yàn)性抗真菌藥物的使用可使熒光定量PCR結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性曲霉菌感染病人經(jīng)藥物治療后，約60％～70％病人血標(biāo)本熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性。為提高檢出率，早日明確診斷，故建議在病人未使用藥物治療之前抽血送檢。此外，一些曲霉菌感染的病人在停用抗真菌藥物之后，有很大的復(fù)發(fā)可能，在治療前后，連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病人血中曲霉菌DNA是必要的。熒光定量PCR結(jié)果持續(xù)陽(yáng)性，往往提示病人預(yù)后很差，病死率較高(6/8)。 研究

10、結(jié)論 ①成功建立侵襲性曲霉菌感染熒光定量PCR檢測(cè)新技術(shù)：自主設(shè)計(jì)的檢測(cè)曲霉菌特異性的引物探針，達(dá)到了國(guó)外相關(guān)研究的水平，有較高的敏感度、特異度。同時(shí)，建立了適合臨床實(shí)驗(yàn)室采用的簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的提取曲霉菌DNA的方法。構(gòu)建了含有目的擴(kuò)增片斷的陽(yáng)性質(zhì)粒做為陽(yáng)性對(duì)照，為產(chǎn)品形成試劑盒打下基礎(chǔ)。 ②完成侵襲性曲霉菌感染熒光定量PCR檢測(cè)新技術(shù)的臨床效能評(píng)價(jià)：檢測(cè)臨床高度疑似曲霉菌感染病人血清，有較高的準(zhǔn)確度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。該方

11、法對(duì)重癥免疫低下患者曲霉菌感染的早期診斷有很大的提示作用。與血清學(xué)方法相比，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果具有更客觀可靠、易于判斷等優(yōu)點(diǎn)。該項(xiàng)技術(shù)有待進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，為今后國(guó)內(nèi)同類研究提供一定的參考依據(jù)。它的較廣闊的臨床應(yīng)用前景，有望早日投入市場(chǎng)，為廣大患者服務(wù)。 課題的創(chuàng)新之處(1)通過(guò)特異性引物、探針的設(shè)計(jì)，建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的曲霉菌熒光定量PCR檢測(cè)新技術(shù)。 (2)建立適合臨床實(shí)驗(yàn)室采用的提取曲霉菌DNA方法。 (