解旋酶依賴性DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于黃曲霉檢測(cè)的研究.pdf

1、目的：將曲霉菌的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）基因作為目的片段設(shè)計(jì)特異性引物，建立恒溫條件下方便、快速檢測(cè)曲霉菌的解旋酶依賴性DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（tHDA）的檢測(cè)技術(shù)，了解tHDA體系建立的擴(kuò)增方法存在的優(yōu)勢(shì)和不足，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：從Ensembl Fungi數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、比對(duì)曲霉菌ITS序列，查找種屬特異性序列，并利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer6.0對(duì)特異

2、性序列設(shè)計(jì)適合恒溫?cái)U(kuò)增體系的引物。利用液氮研磨法提取孢子量約為1×108/ml的黃曲霉，并將所提取的煙曲霉菌基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋，制成模板庫(kù)備用。采用IsoAmp Ⅱ tHDA kit進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，并測(cè)序。同時(shí)進(jìn)行該方法的特異性和靈敏度試驗(yàn)，且與普通PCR方法進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：按IsoAmp Ⅱ tHDA kit試劑盒所建立的反應(yīng)體系及要求，對(duì)黃曲霉進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果及測(cè)序結(jié)果，初步表

3、明該方法可用于黃曲霉的檢測(cè)，通過(guò)與其他菌株的比較，tHDA檢測(cè)方法具有較好的特異性。與普通PCR相比，兩者都可以檢測(cè)模板DNA濃度倍稀至200×10-6ng/mL，但根據(jù)電泳條帶，tHDA的PCR電泳條帶不如普通PCR。
　　結(jié)論：（1）利用IsoAmp Ⅱ tHDA kit試劑盒所建立tHDA反應(yīng)體系可用于黃曲霉的檢測(cè)，甚至是曲霉菌屬，且有較好的特異性。（2）相較于普通PCR，tHDA所建立的體系雖有較高的靈敏度，與普通PCR相