潛藏性產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測體系構(gòu)建及真菌DNA提取技術(shù)的改進(jìn).pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文潛藏性產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測體系構(gòu)建及真菌DNA提取技術(shù)的改進(jìn)姓名：秦文彥申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：馮明光20070501摘要由于黃曲霉毒素(aflatoxin)是人類和畜禽重要的致癌致病因子。因此如何嚴(yán)格控制潛藏產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的食品及飼科等產(chǎn)品受到人們的極大關(guān)注。目前常用的直接檢測法包括薄層層析、液相色譜、免疫化學(xué)分析等多種方法，其設(shè)計(jì)基于黃曲霉毒素的理化性質(zhì)，無法檢出已被產(chǎn)毒真菌污染但

2、尚未產(chǎn)毒的高風(fēng)險(xiǎn)樣品。多重PCR檢測方法，可在單一泳道反應(yīng)體系中同時檢測多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域，具有快捷、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于有害微生物檢測。本研究以產(chǎn)毒真菌黃曲霉(Aspergillusflatus)的基因組DNA為模板，根據(jù)黃曲霉毒素生物合成中關(guān)鍵酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了能夠從樣品中快速靈敏檢測潛藏性產(chǎn)毒真菌的多重PCR檢測體系，并改進(jìn)了真菌DNA樣品的提取方法，使之適于大量樣品檢測的真菌DNA快速提取要

3、求。多重PCR檢測體系的構(gòu)建根據(jù)黃曲霉毒素生物合成中關(guān)鍵酶的調(diào)控基因aflR、omt1和ver1的序列以及真菌共有的58SrDN^的ITS序列分別設(shè)計(jì)出ApaF／ApaR、OmtF／OmtR、VerF／VcrR及ITSI／ITS4等四對引物，用于構(gòu)建快速靈敏檢測飼料或食品中潛藏性產(chǎn)毒真菌的多重PCR反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增的四個DNA片斷分別為1032bp、797bp和600bp，與基因庫中對應(yīng)基因或I)NA序列的同源性達(dá)99％以上，僅45

4、2bp片段與對應(yīng)基因verl的同源性為98％。通過優(yōu)化反應(yīng)體系的組成因子，建立了單管多重PCR反應(yīng)體系并應(yīng)用于6種曲霉和1種青霉的多個菌株DNA樣品的檢測。結(jié)果顯示，四個目標(biāo)片段均清晰地出現(xiàn)在2株黃曲霉和1株寄生曲霉(Aspergillusparasiticua)的DNA樣品中，而其余非產(chǎn)毒菌種的DNA樣品中只能檢出ITS片段，說明檢測特異性十分理想。靈敏性分析結(jié)果表明，多重PCR檢測的保守靈敏度為1ngpL1樣品DNA，且所有目標(biāo)片段