兩種核酸恒溫擴增檢測方法的建立.pdf

1、“快速簡便”是現(xiàn)代分子檢測技術(shù)的發(fā)展方向。近年來或基于DNA/RNA生物合成機制，或基于某些具有特殊功能的核酸酶，產(chǎn)生了一系列核酸恒溫擴增技術(shù)。核酸恒溫擴增技術(shù)對反應(yīng)儀器要求低，在某一恒定溫度下即可進行反應(yīng)。這一獨特優(yōu)勢，極其適合開發(fā)價格低廉、高靈敏度、高特異性的現(xiàn)場診斷產(chǎn)品。本研究對切刻內(nèi)切酶核酸恒溫擴增技術(shù)(NEMA)和依賴于核酸序列的核酸恒溫擴增技術(shù)(NASBA)進行改進，并以沙門氏菌(Salmonella)和單核細(xì)胞增生李斯特氏

2、菌(Listeria monocytogenes)為目標(biāo)菌建立各自的NEMA和NASBA檢測方法。
　　 對傳統(tǒng)NEMA技術(shù)引入切刻內(nèi)切酶識別序列的方法進行了改進，突破了限制NEMA技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。傳統(tǒng)NEMA反應(yīng)需要四條引物，本研究創(chuàng)新性的加入模板預(yù)處理步驟之后，使得反應(yīng)只需要兩條引物即可，大大提高了檢測方法的靈敏度和特異性，所建立檢測方法的靈敏度比傳統(tǒng)PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測法高一個數(shù)量級。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻，所作改進尚屬首

3、次。
　　 傳統(tǒng)NASBA檢測技術(shù)大多以RNA核酸序列為檢測目標(biāo)。本研究嘗試建立以DNA核酸序列為檢測目標(biāo)的NASBA技術(shù)，改進后的NASBA技術(shù)降低了對操作環(huán)境的要求，拓寬了NASBA技術(shù)的應(yīng)用范圍。同時NASBA技術(shù)與核酸薄層層析檢測技術(shù)(Nucleic Acid Thin-layer Chromatography)的結(jié)合，也使得NASBA擴增產(chǎn)物的檢測擺脫了對精密儀器的依賴，為技術(shù)的普及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻，所