抗煙曲霉GM抗體在侵襲性曲霉感染診斷的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、近20年來，臨床上隨著免疫缺陷宿主的不斷增多，真菌感染，特別是深部真菌感染不斷上升，侵襲性真菌感染是深部真菌病中危害最大的一類，常發(fā)生于免疫功能低下的患者，是醫(yī)院感染常見的類型之一。 在侵襲性真菌感染中，曲霉已成為臨床上僅次于念珠菌的重要致病菌。是引起免疫抑制患者嚴(yán)重深部真菌感染的重要病原菌。惡性腫瘤、粒細(xì)胞減少或粒細(xì)胞功能障礙、糖皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑的使用等原因造成的免疫功能低下患者，是侵襲性曲霉病(IA)發(fā)病的高危人群。當(dāng)

2、免疫功能低下患者吸入曲霉菌孢子后，孢子經(jīng)氣管、支氣管、肺泡侵入肺部造成初發(fā)的侵襲性感染，并常伴有遠(yuǎn)隔器官的播散。近10年來，IA發(fā)病率不斷上升，并成為免疫功能低下患者死亡的主要原因之一。侵襲性曲霉病臨床表現(xiàn)多樣化，病情進(jìn)展快，常危及患者的生命，病死率在56-88.1％。早期快速診斷有助于及時(shí)控制病情，改善預(yù)后。 當(dāng)曲霉感染機(jī)體時(shí)，其菌體成分作為抗原釋放于體液中并刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，檢測曲霉菌特異性抗原和抗體將有助于診斷。由于

3、曲霉菌感染的患者本身常常存在嚴(yán)重免疫抑制，無法產(chǎn)生足夠濃度的抗體，且抗體的產(chǎn)生需要一定時(shí)間，往往在起病2周后才逐漸升高，早期診斷受到限制。此外，因曲霉菌在自然界中廣泛存在，人體皮膚、消化道和呼吸道等與外界相通的部位和器官中可存在曲霉菌暫居或定植，機(jī)體不同程度存在抗曲霉菌的抗體，因而特異性抗曲霉菌抗體陽性并不能完全證明機(jī)體存在曲霉菌感染。因此，近年來人們把目光投向了靈敏、特異、快速曲霉菌抗原的檢測上。半乳糖甘露聚糖(galactomann

4、an，GM)是曲霉菌細(xì)胞壁抗原成分，其半乳糖和甘露糖之比為1∶1.17，分子量在25000到75000之間，抗原表位位于末端的半乳呋喃糖，每個(gè)GM上有十幾個(gè)半乳呋喃糖表位。 我們進(jìn)行了如下研究：1、制備煙曲霉GM單克隆抗體(GM-McAb)，建立雙抗體夾心ELISA法檢測煙曲霉GM抗原。2、建立侵襲性曲霉菌感染動(dòng)物模型，用雙抗體夾心ELISA法，檢測感染動(dòng)物血清標(biāo)本中煙曲霉GM抗原；用免疫酶組織化學(xué)方法檢測組織中煙曲霉GM抗原，

5、驗(yàn)證和評(píng)價(jià)煙曲霉GM單克隆抗體在煙曲霉感染動(dòng)物模型中的抗原診斷價(jià)值。3、用煙曲霉GM單克隆抗體進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測臨床侵襲性曲霉感染高危患者血清，評(píng)價(jià)煙曲霉GM單克隆抗體檢測技術(shù)在臨床侵襲性曲霉菌感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 第一部分抗煙曲霉GM單克隆抗體的制備及鑒定 煙曲霉培養(yǎng)擴(kuò)增，提取煙曲霉GM抗原成分，免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞株，最終得到8A2A17、7E11A1、9D

6、47A1、2D27A6，4株可穩(wěn)定分泌抗煙曲霉單抗的雜交瘤細(xì)胞株。免疫熒光檢測抗體效價(jià)，8A2A17、7E11A1、9D47A1可達(dá)1∶32000，而2D27A6僅達(dá)1∶2000。 4株單抗亞類鑒定：8A2A17為IgG1，7E11A1、9D47A1、2D27A6為IgG3 單克隆抗體的免疫熒光檢測顯示，4株單抗均與天然煙曲霉抗原反應(yīng)，可與煙曲霉涂片中的菌絲及孢子結(jié)合，發(fā)出黃綠色熒光。 免疫熒光法檢測煙曲霉單克隆

7、抗體與其他幾種曲霉菌的交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示4株煙曲霉單抗與黃曲霉、土曲霉、黑曲霉之間有交叉反應(yīng)，這與曲霉菌屬之間存有共同的細(xì)胞壁抗原成分有關(guān)。交叉反應(yīng)提示，抗煙曲霉GM單克隆抗體不僅能夠特異地識(shí)別煙曲霉GM抗原成分，而且還能夠識(shí)別其他曲霉菌屬抗原成分， 建立雙抗體夾心ELISA法檢測煙曲霉GM抗原，選擇兩株高親和力并針對(duì)不同抗原決定簇的McAb7E11A1、9D47A1，分別為包被抗體和酶標(biāo)抗體，以純化AFMP1(GM重組蛋白)作

8、為標(biāo)準(zhǔn)檢測品，以相對(duì)應(yīng)牛血清白蛋白(BSA)為陰性對(duì)照，建立雙抗體夾心ELISA法，以平均450nm吸光值(OD)為縱坐標(biāo)，以AFMP1蛋白的濃度為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以AFMP1標(biāo)準(zhǔn)品最大稀釋濃度的OD值是陰性對(duì)照的2倍為最少可測值，結(jié)果顯示檢測最高靈敏度為0.1ng/ml，可測AFMP1標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍0.1～60ng/ml之間在標(biāo)準(zhǔn)曲線上形成直線，表明可測范圍為0.1～60ng/ml。 第二部分建立侵襲性煙曲霉感染動(dòng)物模型

9、及其抗原檢測 將新西蘭大白兔12只分為兩組，組1：實(shí)驗(yàn)組6只；組2：對(duì)照組設(shè)正常對(duì)照4只和免疫抑制對(duì)照4只。實(shí)驗(yàn)組和免疫抑制對(duì)照組兩組動(dòng)物同時(shí)給予靜脈滴注氫化可的松15mg/kg、環(huán)磷酰胺25mg/kg連續(xù)二天；第三天肌肉注射氫化可的松15mg/kg，實(shí)驗(yàn)組給予耳緣靜脈注射5×106CFU/ml的煙曲霉孢子混懸液1ml，免疫抑制對(duì)照組耳緣靜脈注射生理鹽水1ml。分別采集各組大白兔感染前、感染后24、48、72、96小時(shí)血液；感染

10、后96小時(shí)處死兩組兔，無菌下切取肺、肝、脾、腎等臟器，取部分組織制成組織勻漿，其余組織置于10％甲醛溶液中固定8小時(shí)以上，制備組織臘塊備用。 臟器組織培養(yǎng)：將肺、肝、脾、腎組織分別制成組織勻漿，接種于沙堡—氯霉素瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)96小時(shí)以上，觀察煙曲霉菌菌落生長情況、顯微鏡下觀察煙曲霉菌絲、孢子及分生孢子形態(tài)。 臟器組織HE染色：肺、肝、脾、腎組織臘塊HE染色，檢測曲霉菌。 免疫酶組織化學(xué)染色：用辣根過氧

11、化物酶(HRP)標(biāo)記的抗煙曲霉單克隆抗體，對(duì)肺、肝、脾、腎組織作免疫酶組織化學(xué)染色。 雙抗體夾心ELISA法檢測血清：用抗煙曲霉GM單克隆抗體7E11A1、9D47A1，分別作為包被抗體和酶標(biāo)抗體，以雙抗體夾心ELISA檢測血清中煙曲霉抗原。 結(jié)果： 臟器組織培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)組：肺、肝、脾、腎組織勻漿，接種于沙堡—氯霉素瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天，可見特征性煙綠色菌落生長，小培養(yǎng)玻片棉蘭染色，顯微鏡下觀察煙曲霉菌孢子

12、、分生孢子和菌絲，菌絲呈條狀有分隔，菌絲分支呈銳角。對(duì)照組：組織培養(yǎng)未見真菌生長。 臟器組織HE染色：實(shí)驗(yàn)組：肺、肝、脾、腎等組織臟染色分別見有散在和/或聚集的曲霉菌孢子和菌絲，菌絲呈條狀有分隔，銳角分支。對(duì)照組：臟器組織HE染色未見曲霉菌孢子和菌絲。 臟器組織培養(yǎng)和HE染色結(jié)果證明侵襲性曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功。 免疫酶組織化學(xué)染色：實(shí)驗(yàn)組：肺、肝、脾、腎等組織行免疫酶組織化學(xué)染色，可見散在和成堆被染成黃

13、褐色的清晰可見的曲霉菌孢子和菌絲，菌絲呈條狀有分隔，銳角分支。對(duì)照組：未見黃褐色曲霉菌孢子和菌絲。 雙抗體夾心ELISA法檢測：注射煙曲霉孢子混懸液后24小時(shí)即可在血標(biāo)本中檢測到煙曲霉GM抗原，24小時(shí)早期檢測陽性率83％(5/6)；接種后第48-96小時(shí)的血清標(biāo)本檢測均為陽性。正常對(duì)照組及免疫抑制對(duì)照組血清煙曲霉GM抗原檢測均為陰性。染菌后24、48、72、96小時(shí)OD值呈逐漸升高趨勢。 免疫酶組織化學(xué)染色及雙抗體夾心

14、ELISA法檢測結(jié)果顯示，抗煙曲霉單克隆抗體可特異地識(shí)別組織及血清中煙曲霉抗原。 第三部分抗煙曲霉GM抗體在曲霉菌感染抗原檢測的臨床應(yīng)用. 臨床病例資料：臨床曲霉菌感染高危患者15例次，男8例，女7例，年齡3月齡-80歲，其中病理確診為曲霉菌感染2例，高度懷疑曲霉菌感染3例，可疑曲霉菌感染病例10例。收集上述高?；颊哐鍢?biāo)本，低溫凍存?zhèn)溆谩?收集上述高?；颊吲R床資料，包括病人的基本情況、診斷、病情演變、各種檢查結(jié)

15、果特別是微生物學(xué)檢查結(jié)果及病理和影像檢測結(jié)果、治療轉(zhuǎn)歸等。 雙抗體夾心ELISA法檢測臨床高?；颊哐鍢?biāo)本，以抗煙曲霉GM單克隆抗體7E11A1、9D47A1，分別作為包被抗體和酶標(biāo)抗體，作雙抗體夾心ELISA檢測血清中煙曲霉GM抗原。 結(jié)果：以我們制備的抗煙曲霉GM單克隆抗體，作雙抗體夾心ELISA法檢測曲霉菌GM抗原，共檢測臨床高危患者血清標(biāo)本15例，5例陽性，病理確診和臨床高度懷疑曲霉菌感染病例的血清ELISA檢測

16、均為陽性；1例臨床高度懷疑曲霉菌感染患者，采集急性期和恢復(fù)期2份血標(biāo)本動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)果在疾病高峰期血清ELISA檢測強(qiáng)陽性，恢復(fù)期血清ELISA檢測陰性，隨著治療后病情的好轉(zhuǎn)，血清檢測轉(zhuǎn)陰。臨床3例痰培養(yǎng)曲霉菌陽性的可疑病例，經(jīng)雙抗體夾心ELISA法檢測GM抗原為陰性。 上述研究表明，我們從煙曲霉培養(yǎng)物中提取煙曲霉GM抗原成分，免疫小鼠，制備抗煙曲霉GM單克隆抗體，經(jīng)篩選得到特異性好、親和力高、針對(duì)不同抗原決定族的雜交瘤細(xì)胞株，組

17、成配對(duì)McAb，建立一種快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的雙抗體夾心ELISA方法檢測曲霉菌GM抗原。建立侵襲性煙曲霉感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，雙抗體夾心ELISA法檢測結(jié)果顯示，在動(dòng)物感染后24h檢測到血清陽性結(jié)果，之后隨著感染的加重陽性滴度增加；免疫酶組織化學(xué)染色及雙抗體夾心ELISA法檢測結(jié)果顯示，抗煙曲霉單克隆抗體可特異地識(shí)別組織及血清中煙曲霉抗原。臨床高?；颊哐鍣z測顯示，應(yīng)用抗煙曲霉GM單克隆抗體，作雙抗體夾心ELISA檢測高危病人血清GM