探討膠霉毒素在支氣管煙曲霉感染中的作用.pdf

1、目的:通過建立煙曲霉感染支氣管上皮細(xì)胞的體外模型,以探討膠霉毒素在煙曲霉感染中的作用及其機(jī)制。
　　方法:1、觀察膠霉毒素(gliotoxin GT)對(duì)支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells HBE)凋亡和細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)表達(dá)的影響:1)藥物配制:膠霉毒素樣品先溶于95％乙醇中,再用培養(yǎng)基(DMEM)稀釋到所需濃度;2)細(xì)胞接種:將野生型支氣管上皮細(xì)胞以密度為4000/ml接

2、種于直徑9cm培養(yǎng)皿中,每皿5ml,并設(shè)置對(duì)照組;3)加藥:分別設(shè)置3個(gè)濃度,當(dāng)細(xì)胞貼壁48h時(shí)(孔底細(xì)胞長(zhǎng)滿90%以上),加入新鮮含藥培養(yǎng)基5ml,后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。4)結(jié)果的測(cè)定:藥物作用24h后,收集不同濃度組細(xì)胞及提取各組細(xì)胞的總RNA,采用流式細(xì)胞儀和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡和表達(dá)ICAM-1和NF-κB的變化。2、建立煙曲霉感染支氣管上皮細(xì)胞的體外模型。1)菌株的培養(yǎng):將煙曲霉菌接種到PDA瓊脂平板,置于30℃

3、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-4天,連續(xù)活化兩次,PBS重懸孢子并計(jì)數(shù)。2)野生型人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)的培養(yǎng):將支氣管上皮細(xì)胞以密度為4000/ml接種于直徑9cm培養(yǎng)皿中,每皿加入5ml細(xì)胞懸液,后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。3)共培養(yǎng)模型的建立:當(dāng)細(xì)胞密度為90%以上時(shí),按1:1000(菌孢子數(shù):支氣管上皮細(xì)胞數(shù))加入菌懸液,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2h,PBS沖洗,棄上清液,加入一定量的DMEM完全培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng)

4、。4)結(jié)果的測(cè)定:分別于共培養(yǎng)12、24、36h終止實(shí)驗(yàn)以獲取菌絲、支氣管上皮細(xì)胞和12、24、36h提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀(Annexin V-FITC法)和RT-PCR等方法,檢測(cè)真菌表達(dá)膠霉毒素的水平、支氣管上皮細(xì)胞凋亡和ICAM-1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、RT-PCR檢測(cè)HBE凋亡基因表達(dá)的結(jié)果顯示:膠霉毒素處理后,細(xì)胞凋亡基因Bak和Bax均表達(dá)上升(p<0.005和p<0.05)

5、,特別Bak基因表達(dá)最明顯,且與藥物濃度呈一定相關(guān)性;
　　2、真菌RT-PCR的結(jié)果顯示:與對(duì)照組(煙曲霉孢子狀態(tài))相比,模型組中12h和24h時(shí)間點(diǎn)真菌膠霉毒素的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01),而在36h時(shí)間點(diǎn)時(shí)真菌膠霉毒素表達(dá)明顯升高(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、支氣管上皮細(xì)胞凋亡基因的RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組(支氣管上皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí))相比,細(xì)胞凋亡基因從24h時(shí)間點(diǎn)開始表達(dá)上調(diào),到36h時(shí)間點(diǎn)