轉(zhuǎn)基因番茄外源基因檢測方法研究.pdf

1、近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展引起了人們關(guān)注。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為解決人類的食物短缺等問題帶來了福音，然而其引發(fā)的合理性和安全性問題亦成為關(guān)注的焦點。針對轉(zhuǎn)基因植株的安全性和合理性，建立健全轉(zhuǎn)基因作物的檢測方法體系顯得很迫切，尤其是探索一套經(jīng)濟便捷的檢測體系更是當前科研工作的重點。自第一例轉(zhuǎn)基因植株培育成功以來，轉(zhuǎn)基因作物種類不斷增多，番茄作為世界性的蔬菜，針對其性狀和質(zhì)量改良的轉(zhuǎn)基因品系也相繼商品化進入市場。我國是番茄進出口大國，所以針對轉(zhuǎn)基因番茄

2、建立一套番茄轉(zhuǎn)基因檢測方法體系是有必要的。
　　 本文以兩個陽性樣品華番一號和麗春番茄，陰性對照樣品合作903和一個購自市場的隨機抽檢樣品為檢測對象，分別采用傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)、核酸斑點雜交以及微流體芯片技術(shù)，對上述樣品進行了檢測。檢測的外源基因選擇轉(zhuǎn)基因番茄中慣用的35S（花椰菜花葉病毒啟動子）、NOS（胭脂堿合成酶終止子），NPTⅡ(新霉素轉(zhuǎn)移酶基因)，35S-EFE(35S和番茄EFE基因的交聯(lián)結(jié)構(gòu))、內(nèi)參基因選擇番茄La

3、t52（花藥特異表達啟動子），mcpi（金屬羧肽酶），fru（β-呋喃果糖苷酶），apx（抗壞血酸過氧化物酶）。
　　 研究中首先采用傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)和核酸斑點雜交技術(shù)，檢測了外源基因35S、NOS、NPTⅡ、35S-EFE和內(nèi)參Lat52基因。選用質(zhì)粒PBI121為陽性對照、合作903番茄為陰性對照。華蕃一號樣品中4個外源基因和1個內(nèi)參基因均成功檢出，陽性質(zhì)粒PBI121中只有35S、NOS、NPTⅡ基因被檢出，陰性對照番茄

4、合作903中只有內(nèi)參基因Lat52檢出。試驗重復(fù)性良好，檢測靈敏度高，兩種方法相互補充，排除假陽性可能。核酸斑點雜交一次可檢出多個外源基因，增加了檢測數(shù)量，為我國番茄轉(zhuǎn)基因檢測提供參考。
　　 其次本研究將普遍運用于基因表達譜分析等領(lǐng)域的微流體基因芯片技術(shù)運用于轉(zhuǎn)基因番茄檢測，搜索報道的轉(zhuǎn)基因番茄基因信息，設(shè)計了895條針對轉(zhuǎn)基因番茄的外源基因和內(nèi)參基因的寡聚核苷酸探針，每條探針4個重復(fù)，原位合成轉(zhuǎn)基因番茄微流體檢測芯片。分別采

5、用普通PCR-CY3標記、（二次擴增）多重PCR-CY3標記和隨機引物-CY3標記三種CY3標記方案將熒光信號滲入番茄DNA，以華番一號為樣本進行芯片雜交檢測，比較了三種標記方案的標記效果。選取標記效果較好的普通PCR-CY3標記和多重PCR-CY3標記方法分別對陽性品種麗春番茄進行芯片檢測試驗。并用普通PCR-CY3標記的方法檢測了陰性番茄品種合作903以及隨機抽檢的市場品種黃色圣女果番茄。芯片檢測結(jié)果表明:普通PCR-CY3標記、（

6、二次擴增）多重PCR-CY3標記體系較適合芯片檢測樣品處理，而隨機引物標記方法沒得到較好的標記效果。從華番一號、麗春番茄樣品中檢出了35S啟動子、NOS終止子、35S-EFE交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因、NPTⅡ標記基因以及番茄的4個內(nèi)參基因fru、apxmcpi、Lat52的多數(shù)探針信號，四次重復(fù)平均信號值良好，偏差小，信號值較高。合作903番茄的芯片上只有內(nèi)參基因探針檢出信號，而圣女果番茄中不僅檢測到番茄內(nèi)參基因探針信號，4個外源基因的探針均有探針