豐產(chǎn)梨α-法尼烯合成酶基因RNAi和反義表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、虎皮病是蘋(píng)果、梨在低溫貯藏中后期發(fā)生的最嚴(yán)重的生理病害，其主要癥狀是：在果實(shí)表面出現(xiàn)褐色至深褐色的不規(guī)則、凹陷形病斑，形如燙傷，故又稱(chēng)褐燙病。此病一般只發(fā)生于果皮表層細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)也能危及果肉細(xì)胞，極大的影響了果實(shí)的品質(zhì)。 眾多的實(shí)驗(yàn)表明，α-法尼烯與虎皮病的發(fā)生有關(guān)，α-法尼烯的生物合成是通過(guò)類(lèi)異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，調(diào)控此途徑的酶包括3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、α

2、-法尼烯合成酶(AFS)。其中AFS是調(diào)控α-法尼烯合成的最直接的限速酶，它催化法尼基焦磷酸(FPP)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?法尼烯。近年來(lái)通過(guò)α-法尼烯合成酶來(lái)研究虎皮病的分子機(jī)制已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 本研究根據(jù)α-法尼烯合成酶基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特定引物，構(gòu)建RNAi載體和反義表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化豐產(chǎn)梨，以期進(jìn)一步研究α-法尼烯合成酶的功能；同時(shí)，研究影響梨遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響因素，完善了梨再生體系。主要結(jié)果如下：

3、 1、采用TRIZON法從豐產(chǎn)梨再生苗中提取了高質(zhì)量的RNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到了構(gòu)建表達(dá)載體的長(zhǎng)、短片段。 2、利用RT-PCR技術(shù)獲得了來(lái)源于α-法尼烯合成酶基因(PFS)編碼區(qū)的兩個(gè)基因片段，反向連接，經(jīng)PCR擴(kuò)增、限制性?xún)?nèi)切酶消化和序列測(cè)定，驗(yàn)證其序列和設(shè)計(jì)的相一致，成功構(gòu)建了抑制α-法尼烯合成酶基因表達(dá)的RNAi表達(dá)載體PBI-L-S。 3、成功構(gòu)建了反義表達(dá)載體PBI-PFS-L，然后借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)