鴨梨α-法尼烯合成酶基因的克隆及其植物表達載體構建.pdf

1、α-法尼烯是重要的倍半萜類次生代謝物質，具有許多重要的生物學效應。α-法尼烯是果實中主要的香氣成分之一，與昆蟲的誘導產卵有關。Oc一法尼烯是誘導虎皮病發(fā)生的重要因素，虎皮病是梨、蘋果在低溫貯藏的中后期發(fā)生的最嚴重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，在此途徑中調控α-法尼烯合成的酶主要包括HMGR、FPPS、α-法尼烯合成酶。其中α-法尼烯合成酶是調控α-法尼烯合成的關鍵酶，它催化FPP轉變?yōu)棣?/p>

2、-法尼烯。近年來，通過α-法尼烯合成酶來研究虎皮病的分子機制已經成為國內外研究的熱點。 鴨梨屬于白梨品系，中國是鴨梨的主要產地。為研究α-法尼烯合成酶基因的功能，本實驗采用改良的CTAB-LiCl法從鴨梨中提取RNA，根據(jù)GenBank注冊的α-法尼烯合成酶基因序列設計特異引物，通過同源克隆途徑分離了α-法尼烯合成酶基因的編碼區(qū)序列及3’片段序列，通過酶切和連接等分子生物學手段構建了反義、RNAi中間表達載體，并通過凍融法將載體

3、轉化農桿菌，并用于遺傳轉化研究。主要結果如下： 1 采用改良的CTAB-LiCl法從鴨梨中提取了高質量的RNA，經過RT-PCR擴增得到了1824bp鴨梨α-法尼烯合成酶基因(PFS)(GenBank注冊號：DQ364626)。 2 序列分析發(fā)現(xiàn)該cDNA包含一個由1728個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼分子量約66KDa的576個氨基酸殘基的蛋白質。序列相似性分析結果表明，它與蘋果中克隆得到的α-法尼烯合成酶(AFS)

4、基因具有很高的同源性，與來源于黃瓜、杉樹、松樹的α-法尼烯合成酶基因的同源性較低。且具有兩個典型的與酶功能相關的萜類合成酶基因保守結構域：位于N端的RRX8W(33-43)和C端的DDXXD(326-330)。系統(tǒng)進化樹分析表明鴨梨PFS基因屬于萜類合成酶tps b家族。 3 應用Northern雜交技術和高效液相技術(HPLC)分別檢測了該基因在不同部位的表達和α-法尼烯的釋放情況，PFS基因在鴨梨果皮中的表達量最大，葉中的次

5、之，莖、花、根中的表達量相對較少。且PFS基因的表達與α-法尼烯的積累具有高度的協(xié)同性。 4 為了獲得鴨梨突變體轉基因植株，轉錄后能有效抑制PFS基因的表達，利用RT-PCR技術從鴨梨的果皮中獲得了來源于α-法尼烯合成酶基因(PFS)編碼區(qū)的兩個基因片段，反向連接，經PCR擴增、限制性內切酶消化和序列測定，驗證其序列和設計的相一致，成功構建了抑制α-法尼烯合成酶基因表達的RNAi表達載體PBI-l-S。 5 成功構建了反