白木香倍半萜合成酶基因的克隆表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì).pdf

1、國(guó)產(chǎn)沉香為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，是桃金娘目瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg.樹材中的黑色樹脂部分。白木香在自然條件下正常生長(zhǎng)，木質(zhì)部為白色，質(zhì)軟不產(chǎn)樹脂，無香氣。當(dāng)遭受到外界侵害，如自然條件下的雷擊、風(fēng)折、蟲蟻蛀等，以及人為條件下的砍傷、火傷、真菌侵染等情況下，在樹干中產(chǎn)生的黑色樹脂包被心材從而形成沉香（樹脂）。倍半萜類成分是白木香處于逆境脅迫（病原菌侵染、傷害

2、）時(shí)產(chǎn)生的防御物質(zhì)，是沉香（樹脂）中主要的藥效成分，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的生理活性。沉香倍半萜類化合物生物合成的過程中，倍半萜合成酶起到十分關(guān)鍵的作用，研究沉香倍半萜合成酶對(duì)于闡明白木香倍半萜類化合物的生物合成途徑具有重要意義。本研究從沉香cDNA中擴(kuò)增得到2個(gè)倍半萜合成酶基因As-SesTPS與As-SesTPS1，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因的表達(dá)水平，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得的活性蛋白通過GC-MS技術(shù)分析其酶學(xué)性質(zhì)。主要結(jié)果

3、如下：
　　根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，首次克隆得到白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPS1，其開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1671 bp，編碼556個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)軟件分析其與多條倍半萜合成酶基因具有較高相似性，并含有RRx8W和DDxxD的保守序列。As-SesTPS1基因與先前從白木香中克隆得到的倍半萜合成酶基因編碼的氨基酸序列相似性在40％-60%，推測(cè)As-SesTPS1基因?yàn)橐环N新的倍半萜合成酶基因，其可能編碼不同結(jié)構(gòu)類

4、型的倍半萜合成酶蛋白。
　　以Histone為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)As-SesTPS與As-SesTPS1基因在白木香不同部位表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示As-SesTPS與As-SesTPS1基因均在沉香樣品中高表達(dá)，在白木樣品中幾乎沒有表達(dá)，說明二者在白木香產(chǎn)生沉香的過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。
　　將As-SesTPS與As-SesTPS1基因分別插入原核表達(dá)載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-As-S

5、esTPS-BL和pET28a-As-SesTPS1-BL，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，Western-blot鑒定、氨基酸序列測(cè)定，得出二者均以包涵體形式表達(dá)；蛋白表達(dá)最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度1 mM，37℃誘導(dǎo)6 h；經(jīng)純化復(fù)性后得到有活性的不同的倍半萜合成酶。
　　以倍半萜底物FPP與所得As-SesTPS蛋白進(jìn)行酶促反應(yīng)，生成 Nerolidol、β-Bisabolene、Humulene三種倍半萜，