柞蠶溶繭酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)表征及其基因克隆與表達.pdf

1、血栓性疾病日益威脅著人們的生命健康，現(xiàn)有的抗栓或溶栓藥物種類繁多，根據(jù)作用機制不同，發(fā)揮著重要的作用。然而這些藥物普遍存在半衰期短、纖維蛋白親和力差或出血風(fēng)險大等缺陷，因此開發(fā)新型溶栓藥物仍然十分必要。柞蠶(Antheraea pernyi)屬鱗翅目大蠶蛾科，是典型的吐絲營繭昆蟲之一。在蠶蛹羽化過程中，下顎腺會分泌吐出液，水解繭殼中的絲膠，蠶蛾便可“脫繭而出”了。在其吐出液中含有一種酶，稱其為溶繭酶(cocoonase)，不僅可以水解絲

2、膠，還具有精氨酸酯酶活力，與胰蛋白酶性質(zhì)相近，有望開發(fā)成為一種新型溶栓藥物。
　　根據(jù)前人的初步研究，利用CM-Sepharose FastFlow弱陽離子交換層析和SephadexG-50兩步法從柞蠶吐出液中分離得到柞蠶溶繭酶。通過精氨酸酯酶活力測定了其酶動力學(xué)參數(shù)和最適溫度及pH值，利用纖維蛋白原降解實驗和纖維蛋白平板實驗初步驗證了其溶栓功能。根據(jù)N端測序的氨基酸序列，設(shè)計簡并引物，利用RACE技術(shù)克隆得到柞蠶溶繭酶基因全長，

3、并利用大腸桿菌和Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)分別進行了原核表達和真核表達。
　　實驗結(jié)果表明，成功純化出柞蠶溶繭酶，其酶動力學(xué)參數(shù)Km值和Vmax分別為2.577×10-3 mol/L和4.09×10-3μmol/L/s，且其最適溫度和最適pH值分別為30℃和pH8.0。克隆溶繭酶基因全長783 bp，編碼261個氨基酸，通過BLAST同源性比對發(fā)現(xiàn)，柞蠶溶繭酶含有胰蛋白酶家族保守序列“IVGG”。利用MEGA5.0軟

4、件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)柞蠶溶繭酶與家蠶溶繭酶具有62％的相似度，屬于同一進化分支。通過PROSITE蛋白數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸34-260為絲氨酸蛋白酶家族保守域，并且發(fā)現(xiàn)多個絲氨酸蛋白酶家族特有的模型。
　　通過細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品濃度達200 mg/ml時，Hela細胞形態(tài)出現(xiàn)變化，活細胞數(shù)有所減少。皮內(nèi)注射柞蠶溶繭酶實驗發(fā)現(xiàn)，其出血活性(MHD)為2.5 mg/kg體重。體外溶血試驗中，當(dāng)加入30μg溶繭酶時，24