楊樹MXC3基因RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、近年來，楊樹葉銹病發(fā)生十分嚴(yán)重，導(dǎo)致楊樹人工林的生長(zhǎng)受到制約，因此培育速生抗病新品種是目前面臨的十分緊迫的問題之一。楊樹是多年生植物，生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)很難利用常規(guī)育種手段培育出具有目標(biāo)性狀的優(yōu)良品種?，F(xiàn)代基因工程手段可對(duì)現(xiàn)有優(yōu)良品種進(jìn)行抗病性的特異改造，在較短時(shí)間內(nèi)培育出所需的抗病良種。MXC3基因含有Thaumatin family和Protein kinase domain兩個(gè)功能域，可能在楊樹抗葉銹病中起著重要的作用。RNAi

2、（RNA interference）是一種重要的基因沉默技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物基因功能和遺傳改良研究中。本文以楊樹抗銹病MXC3基因?yàn)閷?duì)象，構(gòu)建其RNAi載體，以南林895楊(Populus×euramericana cv.‘Nanlin895’)作為受體材料，開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化研究，以期為MXC3基因的功能研究奠定一定理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了楊樹MXC3基因的RNAi表達(dá)載體，

3、并成功將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌C58中。⑵優(yōu)化了南林895楊莖段初代培養(yǎng)基:MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+0.25％MES+0.2％肌醇。⑶以南林895楊的組培苗葉片作為抗銹病基因MXC3轉(zhuǎn)化的受體材料，建立了高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系：本試驗(yàn)用卡那霉素(Kan)作為篩選抗生素，篩選出卡那霉素(Kan)的適宜濃度為20mg/L㈩用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化MXC3基因，對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的菌液濃度、侵染時(shí)間和篩選方式等因子進(jìn)行研究，得出最

4、優(yōu)轉(zhuǎn)化條件:去除葉片邊緣和主脈，采用遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基的方式，將葉片接種于分化培養(yǎng)基中暗處預(yù)培養(yǎng)3d，然后將葉片浸入到OD600值為0.8的菌液里侵染20min，暗處共培養(yǎng)4d，再延遲篩選10d。利用此轉(zhuǎn)化體系，南林895楊抗性芽誘導(dǎo)率最高達(dá)到19.39％㈩用CTAB法提取本試驗(yàn)獲得的28株抗性植株的DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明有22株呈陽性，初步證明楊樹MXC3 RNAi載體整合到南林895楊樹基因組中，陽性率達(dá)到78.57％㈩C