轉基因干涉BmNPV病毒的gp64與lef-1基因片段對病毒體外增殖的影響.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見且危害最嚴重的一類病原，一旦爆發(fā)對蠶業(yè)影響巨大，如何增強家蠶對該病毒的抗性一直是蠶業(yè)研究的熱點。BmNPV病毒基因組全序列的測定讓我們對這一病原認識得愈發(fā)清晰，某些必需基因對BmNPV病毒的增殖復制起著關鍵作用。因此，抑制這些必需基因的功能性表達成為防治家蠶感染BmNPV的一種有效策略。雙鏈RNA介導的干擾現(xiàn)象能夠特異的介導靶標基因表達沉默，是生物界進化保守且古老的抗病毒機制。本研究選擇

2、家蠶核型多角體病毒侵染傳播過程中具有關鍵作用的gp64基因和病毒晚期表達調控基因lef-1作為靶標，通過轉基因技術與RNAi技術的結合，探討兩個基因片段相應dsRNA對病毒體外復制、增殖的影響，為日后培育家蠶抗病毒品系奠定基礎。本研究主要獲得了如下研究結果：
　　 1.干涉靶基因的克隆及轉基因干擾載體的構建
　　 根據(jù)已報道的BmNPV病毒基因組序列，分別設計引物克隆了gp64基因+233～+867區(qū)域和lef-l基因+

3、85～+754區(qū)域的反向互補片段，經(jīng)測序驗證正確后將目的基因片段以反向串聯(lián)方式分別連入包含兩個不同誘導型啟動子39K Promoter、LEF3 Promoter的載體骨架中，構建了四個轉基因干擾載體并分別將其命名為pigA3-EGFP-39KPgp64、pigA3-EGFP-39KPlefl和pigA3-EGFP-LEF3Pgp64、pigA3-EGFP-LEF3Plef1。
　　 2.培養(yǎng)穩(wěn)定表達目的基因相應dsRNA的轉基

4、因細胞
　　 將獲得的質粒載體轉染家蠶胚胎細胞系BmE和卵巢細胞系BmN-SWU1，利用G418對轉染后的細胞進行兩個半月至三個月的壓力篩選，獲得了穩(wěn)定持續(xù)表達靶基因相應dsRNA的轉基因細胞系。轉基因細胞的熒光率從轉染初期的10％左右分別達到70％和80％左右。
　　 3.靶基因dsRNA對病毒體外增殖的影響
　　 靶基因dsRNA對病毒增殖表現(xiàn)出較好的抑制作用，gp64相應dsRNA的干涉效果優(yōu)于lef-1基