AcMNPV-BmK IT通過(guò)調(diào)控P35和GP64促進(jìn)子代病毒增殖的研究.pdf

1、桿狀病毒是一類有囊膜的雙鏈DNA病毒，易侵染節(jié)肢動(dòng)物，尤其是昆蟲。所以，桿狀病毒在控制蟲害方面發(fā)揮重要作用。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是一種研究最深入的桿狀病毒，被廣泛用作生物殺蟲劑。目前由于其作為殺蟲劑還有一定的局限性，所以研究者利用基因工程的方法來(lái)提高其殺蟲活性，比如刪除不必要的基因、插入抗蟲毒素基因等。BmK IT是一種來(lái)源于東亞鉗蝎的昆蟲特異性毒素，本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了AcMNPV-BmK IT(IE1)重組病毒，

2、并發(fā)現(xiàn)其能提高p35的轉(zhuǎn)錄水平。桿狀病毒P35作為抗凋亡蛋白，既可以抑制細(xì)胞的凋亡，又能促進(jìn)病毒的增殖。因此，研究AcMNPV-BmK IT通過(guò)調(diào)控P35蛋白如何影響宿主凋亡與病毒增殖之間的關(guān)系對(duì)于分析提高病毒的殺蟲活性是至關(guān)重要的。而GP64蛋白作為出芽型病毒BV特有的囊膜蛋白，對(duì)于病毒的出芽是必需的。之前研究表明由AcMNPV IE1啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)的BmK IT可以提高病毒的復(fù)制，那么研究P35蛋白和GP64的調(diào)控關(guān)系以及BmK I

3、T是否和如何調(diào)控GP64的表達(dá)進(jìn)而影響病毒的增殖就顯得尤為重要。
　　本課題在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)三部分實(shí)驗(yàn)來(lái)研究 AcMNPV-BmK IT如何調(diào)控P35和GP64從而提高子代病毒的增殖，可為揭示AcMNPV介導(dǎo)表達(dá)的BmK IT在細(xì)胞和分子水平的抗蟲機(jī)制提供依據(jù)。
　　第一部分重組病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的構(gòu)建。
　　利用 Bac to Bac系統(tǒng)將 Ac-p35

4、基因與 Ac-gp64基因插入中間載體pFastBacDual-EGFP，獲得重組質(zhì)粒 pFastBacDual-p35-EGFP和pFastBacDual-gp64-EGFP。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 DH10Bac感受態(tài)，獲得重組桿粒Bacmid-p35-EGFP和 Bacmid-gp64-EGFP。接著，將重組桿粒 Bacmid-p35-EGFP和Bacmid-gp64-EGFP轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞，獲得重組病毒顆粒 AcMNPV-p35-E

5、GFP和AcMNPV-gp64-EGFP。通過(guò)蝕斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒活力， AcMNPV-p35-EGFP的活力為2×106 pfu/ml，而 AcMNPV-gp64-EGFP的病毒的活力為1×106 pfu/ml。這為后續(xù)研究提供了材料。
　　第二部分AcMNPV-BmK IT通過(guò)調(diào)控P35蛋白影響宿主凋亡與病毒增殖之間的互作。
　　本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AcMNPV-BmK IT(IE1)與AcMNPV相比可提高病毒的復(fù)制，

6、并能上調(diào)病毒凋亡抑制基因p35的轉(zhuǎn)錄水平，那么P35蛋白的上調(diào)表達(dá)會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生怎樣的影響？這一節(jié)我們分析了過(guò)表達(dá) P35是如何影響宿主凋亡與病毒增殖之間的互作。首先，為分析P35如何影響宿主Sf9細(xì)胞關(guān)鍵凋亡蛋白SfP53的表達(dá)，我們用AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP侵染Sf9細(xì)胞，western blot檢測(cè)了SfP53的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AcMNPV-p35-EGFP侵染36 h后能夠延緩SfP53的

7、表達(dá)，且其表達(dá)量在病毒侵染48 h后達(dá)到最大，是AcMNPV處理組的1.4倍。由于P53是ATM與ATR最重要的底物之一，那么過(guò)表達(dá)P35又是如何調(diào)控DNA損傷應(yīng)答？用喜樹堿(CPT)、AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP處理Sf9細(xì)胞，western blot檢測(cè)了組蛋白H2AX的磷酸化水平。結(jié)果表明，兩組病毒處理組均能觀察到與喜樹堿(CPT)處理組中類似的現(xiàn)象，但是AcMNPV-p35-EGFP處理組在侵染Sf9細(xì)胞12-3

8、6 h后，H2AX的磷酸化水平明顯高于AcMNPV處理組組。為了進(jìn)一步分析強(qiáng)烈的DNA損傷應(yīng)答是否與病毒的復(fù)制有關(guān)，我們檢測(cè)了gp64基因的轉(zhuǎn)錄水平以及子代病毒的生成量。結(jié)果表明，與 AcMNPV處理組相比， AcMNPV-p35-EGFP能夠顯著的提高gp64的轉(zhuǎn)錄水平，并且在侵染96 h后，轉(zhuǎn)錄水平是AcMNPV處理組的39524.60倍。而且較AcMNPV處理組，子代病毒的產(chǎn)量從病毒侵染24 h后開始有顯著性變化，直到侵染96 h

9、后，子代病毒的產(chǎn)量提高了25.5％。為了進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)P35后病毒與宿主之間的相互關(guān)系，用Realtime-PCR檢測(cè)了P35對(duì)病毒凋亡抑制基因iap1/2的影響，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)P35均能提高iap1/2的轉(zhuǎn)錄水平，但是更有利于iap1的轉(zhuǎn)錄，在病毒侵染96 h后，其轉(zhuǎn)錄水平是AcMNPV處理組的47952.18倍。以上結(jié)果揭示了AcMNPV-BmK IT通過(guò)調(diào)控P35來(lái)提高子代病毒增殖的機(jī)制。
　　第三部分為了驗(yàn)證上述機(jī)制，

10、選擇受P35調(diào)控的重要的病毒囊膜蛋白GP64為研究對(duì)象，分析受 AcMNPV早、晚期啟動(dòng)子 IE1、P10和 PH調(diào)控的三種病毒AcMNPV-BmK IT(IE1, P10, PH)對(duì)GP64的表達(dá)進(jìn)而對(duì)病毒增殖的影響。
　　首先，為明確 GP64在子代病毒生成中的作用，用 AcMNPV與AcMNPV-gp64-EGFP處理 Sf9細(xì)胞，檢測(cè)子代病毒的生成量，結(jié)果表明， AcMNPV-gp64-EGFP侵染Sf9細(xì)胞26 h、32

11、 h后，較AcMNPV處理組，子代病毒的生成量分別提高了11.34％、12.69％，這說(shuō)明GP64是子代病毒囊膜生成過(guò)程中關(guān)鍵的蛋白，過(guò)表達(dá)GP64可提高子代病毒的增殖量。
　　接著，為了分析重組病毒AcMNPV-BmK IT對(duì)子代病毒生成關(guān)鍵蛋白GP64定位與表達(dá)的影響，用AcMNPV、AcMNPV-BmK IT(IE1, P10, PH)四種病毒侵染細(xì)胞6-32 h，免疫熒光分析不同處理組中不同時(shí)間點(diǎn)GP64的定位以

12、及積累量，結(jié)果表明，在四種病毒侵染6 h后均有GP64的表達(dá)，但經(jīng)IE1啟動(dòng)子調(diào)控的BmK IT處理組，提早了GP64蛋白在細(xì)胞質(zhì)的積累并向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，推測(cè)有利于病毒的提早出芽。而相較于AcMNPV-BmKIT(IE1)處理組，經(jīng)P10和PH啟動(dòng)子調(diào)控的BmK IT處理組，推遲了GP64在細(xì)胞質(zhì)中的大量積累，但這也為病毒的出芽提供了有利的條件。這些結(jié)果說(shuō)明不同啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的BmK IT對(duì)GP64的分布以及表達(dá)量均有明顯的影響。

13、　　最后，分別用三種重組病毒以及野生型病毒處理Sf9細(xì)胞6-32 h，取上清檢測(cè)子代病毒的生成量，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，三種重組病毒處理組子代病毒的生成量高于野生型病毒處理組，并且經(jīng)P10調(diào)控的BmK IT處理組病毒的生成量要高于經(jīng)IE1以及PH調(diào)控的BmK IT處理組。在病毒侵染細(xì)胞32 h后，AcMNPV-BmK IT(P10)處理組中，子代病毒的生成量比AcMNPV、AcMNPV-BmK IT(IE1)、 AcMNPV-BmK I