Diversin通過JNK促進非小細胞肺癌的增殖和侵襲能力.pdf

1、前言：
　　Diversin也被稱作錨蛋白重復序列包含蛋白6(ANKRD6)，它是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動物中的同源異構體，同時參與經(jīng)典Wnt/beta-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/JNK通路（即PCP通路）。而Diego則是PCP通路的核心蛋白，它與Fz-Dsh信號相關。研究發(fā)現(xiàn)在新生小鼠和成鼠腦內，Diversin表達于室下區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)母細胞和成熟神經(jīng)元，并證實Diversin可以促進其增殖活性。在胚胎發(fā)育過程中

2、Diversin通過非經(jīng)典Wnt/JNK通路調節(jié)斑馬魚胚胎的原腸胚運動以及控制心臟前體的融合。Diversin作為一個分子開關，可以抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，促進非經(jīng)典的Wnt/JNK通路。另外，Diversin含有一些核定位信號，轉移入核后可以和轉錄因子AF9相互作用，而AF9能夠顯著增加Diversin引起的JNK活性增加。Wnt和PCP信號成員可以調控Diversin的亞細胞定位從而影響其在通路中的作用。Diver

3、sin蛋白位于細胞的中心小體，這種獨特的細胞器以及衍生的纖毛在許多信號通路，包括Hedgehog, Wnt，PDGF和FGF中扮演了重要的角色。
　　目前Diversin在人類腫瘤中的表達情況及意義尚不清楚，其是否具有調控腫瘤細胞增殖或侵襲的能力及分子機制等都有待于進一步探討。在本研究中，我們用免疫組化和western blot等方法檢測了Diversin蛋白在肺癌組織和細胞系中的表達，通過雙向調控Diversin的表達，分別檢測

4、Diversin對經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路中重要蛋白的影響，初步探討了Diversin對肺癌細胞增殖侵襲的影響和可能的作用機制。
　　材料與方法：
　　一、組織標本與患者資料
　　167例非小細胞肺癌(NSCLC)組織和38例癌旁正常肺組織均來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2004-2006年存檔蠟塊。在167例肺癌病例中具有完整隨訪資料的74例。隨訪是從手術之日起到隨訪結束日期或由于復發(fā)、轉移而死亡之日止。患者（1

5、06例男性，61例女性）年齡29-81歲，中位年齡60歲。根據(jù)第七版國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標準，Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ期74例，Ⅳ期5例。根據(jù)WHO2004肺癌組織學分類標準，腺癌94例，鱗癌73例。所有患者術前均未接受化療或放射治療。為用于蛋白質分析，另收集20例新鮮的肺癌組織及相對應的癌旁正常的肺組織，保存在-70℃冰箱內。
　　二、免疫組織化學染色
　　手術切除的組織均經(jīng)過10％中性福爾馬林固定后，石蠟包埋，制

6、成4μm切片，采用SP免疫組化法進行染色。一抗使用鼠源性的Diversin，以1∶100(Anti-Diversin購于Santa Cruz Biotechnology， USA)4℃孵育過夜。以PBS代替一抗作為空白對照。生物素標記的二抗IgG(Fuzhou，China)37℃孵育20min，DAB顯色。結果判定:每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細胞。根據(jù)計數(shù)細胞著色的百分比，將Diversin的表達劃分為5個等級:無

7、著色為0分，1％-25％為1分，26％-50％為2分，51％-75％為3分，76％以上為4分。再根據(jù)細胞著色的強度，將Diversin的表達劃分3個等級:無著色為0分，淺黃色顆粒為1分，深黃色或者黃褐色顆粒為2分。將二者相乘，所得乘積即為該切片的最終得分。Diversin陽性表達定位于胞漿和胞膜。根據(jù)38例正常的支氣管上皮染色后，其得分均為＜3分，于是實驗中將得分＜3分的計為陰性表達（正常表達），而得分≥3分的計為陽性表達（高表達）。<

8、br>　　三、細胞培養(yǎng)
　　A549，H1299 and H157細胞系購于美國標準細胞培養(yǎng)所(Manassas,VA，USA);SPC-A-1、LTEP-A-2和正常支氣管上皮細胞系HBE購于上海細胞庫（Shanghai，China）;PG-BE1和PG-LH7由北醫(yī)鄭杰教授饋贈。細胞培養(yǎng)基采用RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，其中含10％熱滅活新鮮小牛血清(Invitrogen)，用25

9、cm培養(yǎng)瓶在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化傳代。
　　四、質粒構建與轉染
　　pcDNA3.1-HA-Diversin質粒由Walter Birchmeier教授(Max Delbrueck-Centerfor Molecular Medicine，Berlin，Germany)惠贈。 Diversin siRNA由上海吉瑪合成，轉染試劑lipo2000購于Invitrogen(C

10、arlsbad，CA，USA).siRNA干擾序列如下:ANKRD6-HOMO-2171:5'GAGGCACUCAAACUAAGAATT3',5'UUCUUAGUUUGAGUGCCUCTT3'ANKRD6-HOMO-1428:5'GAACCUGCAUGCUCAUAAUTT3',5'AUUAUGAGCAUGCAGGUUCTT3'ANKRD6-HOMO-883:5'GCGCGCUAUAAUCACUUGUTT3',5'ACAAGUGAUUAU

11、AGCGCGCTT3'NC:5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3',5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'。
　　五、Western Blotting
　　將收集的培養(yǎng)細胞或剪成2mm的肺癌組織塊用細胞裂解液(Pierce，Rockford，IL，USA)裂解后提取總蛋白，用Bradford method進行定量，10％SDS-PAGE電泳，上樣量為80ug，轉印到PVDF膜(Millipore, B

12、illerica，MA，USA)，一抗4℃過夜，二抗37℃，2h，ECL發(fā)光后，Bio-Image system(EpiChemiⅢ Darkroom，UVP)進行條帶灰度值測定，以與GAPDH的比值作為相對表達量。實驗重復三次取均值。
　　六、Real-Time PCR
　　使用ABI7900實時定量PCR儀，采用SYBR primescript RT-PCR KitⅡ(TakaraBiotechnology)進行反轉錄和

13、PCR反應。反應條件為95℃ for30 see，40 cycles of95℃ for5 sec,60℃ for30 Sec。
　　七、MTT
　　在96孔板中用含10％血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)約4000個左右的轉染24小時后的LTE、H1299細胞，每個孔加入50微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液，在37℃孵育4小時后，去除溶液，用150微升的DMSO溶解生成的MTT結晶，用分光光度計檢測550nm

14、波長的吸收峰值進行定量。
　　八、細胞基質膠侵襲實驗
　　在24孔板中以雙無的1640培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋基質膠(BDBiosciences)，鋪8微米孔徑的上室(Costar)。然后將轉染48小時后的LTE、H1299以100微升含有3×105個的細胞密度接種在上室并孵育。下室放含有10％小牛血清的培養(yǎng)基。6小時后，加入JNK抑制劑(SP600125)30μM。孵育20小時后，甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機選取1

15、0個視野，計數(shù)侵襲到小室下的細胞數(shù)。實驗重復三次，取平均值。
　　九、統(tǒng)計學分析
　　所有的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版本進行統(tǒng)計學分析。采用Chi-Square檢驗Diversin表達與臨床病理因素之間的關聯(lián)。采用t檢驗檢測Western Blot結果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法檢測Diversin對患者生存時間的影響。P＜0.05作為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　一、Diversin蛋白過表達與

16、非小細胞肺癌分化、分期、淋巴結轉移和不良預后有關
　　免疫組化結果顯示38例正常肺組織中Diversin均為陰性表達，而肺癌組織中Diversin陽性率為67.67％(113/167)，二者具有明顯的差異(P＜0.001)，并且其高表達與非小細胞肺癌的低分化（高分化:中-低分化P=0.006）、高p-TNM分期(Ⅰ-Ⅱ∶Ⅲ-Ⅳ P=0.030)、淋巴結轉移(P=0.048)和不良預后（Kaplan-Meier生存分析，P=0.00

17、7）密切相關。Western blot結果顯示在7種肺癌細胞系中5種diversin蛋白表達明顯高于正常支氣管細胞系HBE;在20對非小細胞肺癌新鮮配對組織中，有14例癌表達高于癌旁組織(70％)。
　　二、轉染Diversin促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲
　　我們在diversin表達相對較低的肺癌細胞系LTE中轉染diversin質粒，而在表達相對較高的肺癌細胞系H1299中轉染特異性siRNA，發(fā)現(xiàn)轉染48小時后，與

18、轉染空質粒的細胞相比，轉染diversin質粒的細胞在增殖能力（0.51±0.02 VS0.69±0.01 P＜0.05）和侵襲能力明顯增強(12±2 VS45±5 P＜0.05)。而轉染特異性siRNA的細胞，增殖能力明顯下調（0.63±0.02 VS0.53±0.01 P＜0.05），侵襲能力也出現(xiàn)了明顯抑制(97±5 VS44±6 P＜0.05)。
　　三、Diversin通過JNK促進肺癌細胞增殖與侵襲能力
　　轉染

19、diversin質粒的肺癌細胞P-JNK/JNK水平明顯增加，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4變化不大;相反在轉染特異性siRNA的肺癌細胞P-JNK/JNK水平明顯降低，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4也沒有顯著變化。我們在轉染diversin質粒后又加入JNK抑制劑SP600125（30μM），這時磷酸化JNK水平受到明顯抑制，此時MTT檢測結果發(fā)現(xiàn)肺癌細胞增殖能力明顯減弱(DMS

20、O0.51±0.03 VS0.59±0.02;SP6001250.48±0.02 VS0,49±0.03)，同時transwell檢測結果發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲能力亦受到明顯抑制（DMSO11±3 VS43±4;SP6001259±2VS14±3）。
　　結論：
　　1、Diversin在NSCLC組織中高表達并與患者的不良預后相關。
　　2、轉染Diversin可促進NSCLC細胞的增殖和侵襲。
　　3、Diversi