Dishevelled家族蛋白表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌并通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展.pdf

1、Wnt/β-catenin信號(hào)通路在從水螅到人等動(dòng)物的胚胎發(fā)育和干細(xì)胞維持中其重要作用。該通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是調(diào)節(jié)細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性。在沒(méi)有Wnt信號(hào)的情況下，由APC、Axin、GSK3β和CKIa等組成的復(fù)合物能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的游離β-catenin并介導(dǎo)它通過(guò)磷酸化依賴的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)快速降解，從而使細(xì)胞內(nèi)游離的β-catenin保持在極低的水平。這時(shí)候TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，從而抑制Wnt

2、下游靶基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞外Wnt分子達(dá)到一定濃度時(shí)，Wnt分子與細(xì)胞膜受體Frizzled(Fz)結(jié)合并使之激活。激活的Fz能促進(jìn)細(xì)胞漿內(nèi)的Dishevelled(Dvl)在細(xì)胞膜處多聚化并與LRP5/6結(jié)合形成配體-受體復(fù)合物而募集Axin至細(xì)胞膜處或促進(jìn)其降解。此時(shí)，APC、Axin、GSK3β和CKIa等組成的降解復(fù)合物解散或形成減少，β-catenin的磷酸化和降解過(guò)程被抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin水平升高并在細(xì)胞

3、漿內(nèi)蓄積，進(jìn)而入核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)的基因如c-myc、cyclin D1等已被證實(shí)為Wnt/β-catenin通路的靶基因。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活可以導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生，如大腸癌及肝癌等。雖然β-catenin在許多腫瘤中存在異常表達(dá)，但是β-cmenin基因的突變卻并不常見(jiàn)，因此Wnt/β-catenin通路的激活可

4、能是由于β-catenin上游分子的改變導(dǎo)致。Dishevelled(Dvl)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中位于β-catenin上游的正向調(diào)節(jié)因子，其在Wnt/β-catenin通路中的作用機(jī)制仍不清楚。人類Dishevelled基因家族有DVL1、DVL2和DVL3三個(gè)成員，分別定位于染色體1p36、17p13.2和3q27。它們編碼的三種蛋白(Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3)均包含高度保守的DIX、PDZ和DEP三個(gè)基

5、本結(jié)構(gòu)域。最近有研究報(bào)道乳腺癌、前列腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、大腸癌和肺癌中存在Dvl的過(guò)表達(dá)并提示W(wǎng)nt/β-catenin通路可能存在異常激活，但這些研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，而且研究的樣本量很小。此外，Dvl在腫瘤中的表達(dá)與臨床病理因素之間是否存在相關(guān)性，尚不清楚。本課題主要研究非小細(xì)胞肺癌中Dvl家族各成員的表達(dá)情況，分析它們與肺癌患者臨床病理因素和β-catenin表達(dá)的關(guān)系，同時(shí)探討Dvl過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞β-catenin表達(dá)及侵襲能力

6、的影響。旨在揭示Dvl和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 113例非小細(xì)胞肺癌患者的原發(fā)灶組織及其中39例患者的配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織標(biāo)本收集自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2003～2006年存檔蠟塊。原發(fā)灶蠟塊均包含正常肺上皮組織。113例患者中，男性68例，女性45例，男女性別比1.5：1。手術(shù)切除時(shí)患者年齡20～81歲(中位年齡57歲)。按UICC(2002年)腫瘤TNM

7、分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期56例，Ⅳ期6例。按WHO(2004年)肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗狀細(xì)胞癌48例，腺癌65例。所有病例術(shù)前均未接受過(guò)放、化療。我們采用免疫組化SP法檢測(cè)了這113例標(biāo)本中總Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的表達(dá)，同時(shí)對(duì)其中39例患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶配對(duì)標(biāo)本的Dvl和β-catenin蛋白表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析。此外，我們?cè)贒vl-2有一定豐度表達(dá)而Dvl-1和Dvl-3低/無(wú)表達(dá)的A549肺腺癌細(xì)

8、胞系和QG56肺鱗癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Dvl-1和Dvl-3后，通過(guò)間接免疫熒光染色、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫印跡(Western blotting)和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)了外源性Dvl-1和Dvl-3表達(dá)對(duì)β-catenin表達(dá)及肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 分化成熟的正常支氣管上皮和肺泡上皮總Dvl蛋白及Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3均呈陰性表達(dá)。而肺癌組織中總Dvl陽(yáng)性表達(dá)率為53.

9、1％(60/113)，在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌(p<0.01)，并與肺癌低分化有關(guān)(p<0.05)。肺癌中總Dvl的表達(dá)與高pTNM分期有關(guān)(Ⅲ-IV期vs．Ⅰ-Ⅱ期，p<0.05)。肺癌中存在Dvl各亞型的表達(dá)，Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3陽(yáng)性率分別為36.3％(41/113)、36.3％(41/113)和41.6％(47/113)，它們?cè)谙侔┲械谋磉_(dá)均高于鱗癌(p<0.01)并與肺癌的低分化有關(guān)(p<0.05)。Ⅲ-Ⅳ

10、期肺癌中Dvl-1和Dvl-2的表達(dá)明顯高于Ⅰ-Ⅱ期肺癌(P<0.05)。在39例配對(duì)肺癌資料中，總Dvl、Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性表達(dá)率分別87.2％(34/39)、69.2％(27/39)、51.3％(20/39)和69.2％(27/39)，在原發(fā)灶中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.1％(25/39)、48.7％(19/39)、35.9％(14/39)和48.7％(19/39)?？侱vl、Dvl-1和Dvl-

11、3在淋巴結(jié)中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于配對(duì)原發(fā)灶組織(p<0.05)。Dvl-2在轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。配對(duì)資料中，原發(fā)灶總Dvl和Dvl-2的表達(dá)與β-catenin表達(dá)相關(guān)(p<0.05)，而Dvl-1和Dvl-3的表達(dá)與β-catenin表達(dá)無(wú)關(guān)(p>0.05)；轉(zhuǎn)移灶中總Dvl和Dvl-1的表達(dá)與β-catenin表達(dá)相關(guān)(p<0.05)，而Dvl-2和Dvl-3的表達(dá)與β-catenin表達(dá)無(wú)關(guān)(p>0

12、.05)。在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染Dvl-1后A549和QG56細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的Dvl-1蛋白核定位，但轉(zhuǎn)染Dvl-3的A549和QG56細(xì)胞卻無(wú)明顯Dvl-3蛋白核定位。過(guò)表達(dá)Dvl-1或Dvl-3對(duì)兩種肺癌細(xì)胞系的β-catenin mRNA水平均無(wú)明顯影響(p>0.05)，但過(guò)表達(dá)Dvl-1能上調(diào)A549和QG56細(xì)胞β-catenin蛋白水平(p<0.05)，而過(guò)表達(dá)Dvl-3不影響QG56細(xì)胞的β-catenin蛋白水平(p>0.

13、05)，卻下調(diào)了A549細(xì)胞的β-catenin蛋白水平(p<0.05)。在A549和QG56肺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Dvl-1或Dvl-3后，兩種肺癌細(xì)胞系的侵襲能力均明顯強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞(p<0.01)。 結(jié)論： 1、肺鱗癌和腺癌中存在Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，而分化成熟的肺支氣管上皮對(duì)任何一種Dvl蛋白均呈陰性表達(dá)。肺腺癌中Dvl蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于鱗癌并與肺癌的低分化有關(guān)。 2、Dvl-1和

14、Dvl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與肺癌的高TNM分期相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Dvl-1和Dvl-3蛋白表達(dá)高于原發(fā)灶。原發(fā)灶Dvl-2與β-catenin表達(dá)相關(guān)，而轉(zhuǎn)移灶中Dvl-1與β-catenin表達(dá)相關(guān)。 3、過(guò)表達(dá)Dvl-1和Dvl-3均能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。在不影響β-catenin轉(zhuǎn)錄水平的情況下，過(guò)表達(dá)Dvl-1能升高肺癌細(xì)胞的β-catenin蛋白水平，而過(guò)表達(dá)Dvl-3不改變甚至降低肺癌細(xì)胞的β-catenin蛋白水平