TRIM66在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)并促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展.pdf

1、目的:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其致死率居高不下。目前針對肺癌的治療方法主要包括外科治療，化學(xué)治療和放射治療。但化療一般難以達(dá)到治愈非小細(xì)胞肺癌的效果。而放射治療過程中往往會(huì)發(fā)生放療抵抗現(xiàn)象，成為限制放療效果的關(guān)鍵因素。因此尋找和鑒定肺癌的分子標(biāo)記物，對于早期診斷、治療以及判斷肺癌的預(yù)后情況十分重要。TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族成員通常具備E3泛素連接酶活性，在細(xì)胞的各項(xiàng)生理過程中發(fā)揮多樣性的生

2、物學(xué)功能。越來越多的研究表明TRIM家族蛋白在生物體發(fā)展過程中獨(dú)有的非常重要的作用，該家族蛋白的異常表達(dá)可能誘發(fā)多種類型的疾病，包括發(fā)育障礙，免疫系統(tǒng)疾病甚至是惡性腫瘤。TGF-β是生物體內(nèi)一種擁有多種功能的活性細(xì)胞因子。Smad蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子。TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。最近有研究顯示，骨肉瘤組織中TRIM66的表達(dá)水平顯著高于正常組織，并且TRI

3、M66過表達(dá)與患者較高的局部復(fù)發(fā)率，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及較短的生存期密切相關(guān)。在骨肉瘤細(xì)胞中沉默TRIM66能夠明顯抑制TGF-β/Smad信號通路，提示TRIM66可能通過TGF-β/Smad調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲。然而，在非小細(xì)胞肺癌中，TRIM66是否通過TGF-β/Smad信號通路影響細(xì)胞的惡性行為以及具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究的目的是探索TRIM66促進(jìn)肺癌增殖與侵襲以及介導(dǎo)化療耐藥的相關(guān)機(jī)制，同時(shí)揭示TRIM66通過TGF-β/

4、Smad/EMT信號通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的惡性生物學(xué)行為。
　　研究方法:1、樣本來源:本次研究獲得了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。非小細(xì)胞肺癌組織以及相應(yīng)癌旁正常組織取自于在該醫(yī)院確診為非小細(xì)胞肺癌并且進(jìn)行手術(shù)切除的患者。臨床和組織病理學(xué)的數(shù)據(jù)，包括組織病理學(xué)診斷以及腫瘤分級均取自患者的醫(yī)療記錄。患者在術(shù)前未經(jīng)過化療和放療。2、免疫組織化學(xué):腫瘤組織樣本用10％中性福爾馬林進(jìn)行固定并用石蠟進(jìn)行包埋，制備4μ m厚度的

5、樣本。樣本用二甲苯進(jìn)行脫蠟，然后用濃度梯度的酒精進(jìn)行再水化。接著使用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。使用雙氧水進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷。使用山羊血清減少非特異性連接。進(jìn)行一抗孵育，使用的抗體為TRIM66(mouse monoclonal antibody，1∶200 dilution)，孵育條件為4℃，過夜。鼠免疫球蛋白作為陰性對照。接著進(jìn)行二抗孵育及DAB顯色，復(fù)染使用蘇木精染色液，封片前用濃度梯度酒精進(jìn)行脫水。兩位病理專家對所有樣本

6、進(jìn)行隨機(jī)檢測，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野在放大400倍條件下均可觀察到100個(gè)細(xì)胞。TRIM66的免疫組織化學(xué)染色采用半定量法進(jìn)行估測，包括腫瘤區(qū)域強(qiáng)度以及腫瘤細(xì)胞的百分比。TRIM66染色強(qiáng)度分為0(negative)，1(weak)，2(moderate)，3(strong)。按腫瘤細(xì)胞染色百分比分為1(1-25％)，2(26-50％)，3(51-75％)，4(76-100％)。樣本的最后評分為染色強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞百分比得分的

7、乘積，范圍在0-12之間。評分小于6為TRIM66低表達(dá)，大于等于6為TRIM66高表達(dá)。3、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H1299購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5％。細(xì)胞接種密度都為1∶2，生長2-3d即可傳代一次。TRIM66質(zhì)粒購自origene公司，TRIM66干擾購自Dharmacon公司

8、。將細(xì)胞采用常規(guī)方法進(jìn)行適當(dāng)消化，均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長成為單層70％密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48小時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4、Western blot:細(xì)胞總蛋白的提取用RIPA裂解液，定量方法參照Bradford法。蛋白樣品轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，并進(jìn)行一抗孵育。一抗使用的抗體為TRIM66(1∶1

9、000)，p-Smad2(1∶1000), snail(1∶1000), slug(1∶1000), E-cadherin(1∶1000), N-cadherin(1∶1000),ZO-1(1∶1000)，GAPDH(1∶2000)，抗體孵育的條件為4 ℃，過夜。二抗孵育所用抗體為過氧化物酶耦合的山羊抗兔/鼠抗體(1∶2000)，孵育條件為37℃，兩小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)用.ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，使用DNR Imaging System進(jìn)行曝光。

10、5、集落形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者干擾后48小時(shí)，收集細(xì)胞并接種于直徑為6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，接種密度約為1000個(gè)/皿。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7周，用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞表面，并用吉薩姆染色液進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，超過50個(gè)細(xì)胞的集落即可進(jìn)行計(jì)數(shù)。6、MTT實(shí)驗(yàn):細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者干擾后24小時(shí)，收集細(xì)胞并接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度約為每孔3000個(gè)細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)5天。檢測細(xì)胞活力時(shí)，每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液，并繼續(xù)

11、在37℃條件下培養(yǎng)4小時(shí)。將培養(yǎng)基去除，每孔加入150μl DMSO。用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，檢測波長為490nm。7、流式細(xì)胞術(shù):細(xì)胞的凋亡水平通過AnnexinⅤ/PI雙染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，所用儀器為FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀。細(xì)胞的周期變化情況通過PI單染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，所用儀器為FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀。8、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn):細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用24孔Transwell小室，每個(gè)小室用20μ l基質(zhì)膠進(jìn)行包被（基質(zhì)膠稀釋比

12、例為1∶3）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，并用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。將稀釋后的細(xì)胞懸液加入到transwell上室中，下室加入含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃條件下培養(yǎng)16小時(shí)。將未闖過基質(zhì)膠的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，將穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞用4％多聚甲醛進(jìn)行固定，用蘇木精進(jìn)行染色。隨機(jī)選取5個(gè)視野并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。9、統(tǒng)計(jì)分析:統(tǒng)計(jì)分析所用軟件為SPSS16.0。分析TRIM

13、66表達(dá)水平與臨床病理因素之間的相關(guān)性用卡方檢驗(yàn)法。分析胃癌患者的生存概率用Kaplan-Meier檢驗(yàn)法。分析不同組別患者生存率的差異采用Mantel' slog-rank檢驗(yàn)法。Cox回歸模型應(yīng)用于多變量分析。實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異采用Student's t檢驗(yàn)法。p＜0.05表示具有顯著差異。
　　結(jié)果:1、TRIM66在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義。通過免疫組織化學(xué)方法檢測了非小細(xì)胞肺癌以及相應(yīng)癌旁正常組織中TRIM6

14、6的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TRIM66在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)量顯著增加，而在癌旁正常組織中表達(dá)量較低。進(jìn)一步分析TRIM66表達(dá)水平與臨床病理因素之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TRIM66高表達(dá)與腫瘤惡性分化程度正相關(guān)(p=0.0283)。另外，TRIM66高表達(dá)與肺癌患者的p-TNM分期(p=0.0002)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.0133)有著顯著關(guān)系。進(jìn)一步分析TRIM66與生存時(shí)間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)TRIM66高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯小于TRIM66低表

15、達(dá)的患者的生存時(shí)間(p＜0.05)。COX多因素分析發(fā)現(xiàn)TRIM66高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌獨(dú)立的預(yù)后因素。2、TRIM66促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲，并增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性。我們將TRIM66質(zhì)粒和siRNA分別轉(zhuǎn)染于A549，H1299兩株肺癌細(xì)胞系，并將處理后的細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，集落形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)以分析TRIM66對細(xì)胞增殖，周期，侵襲產(chǎn)生的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染TRIM66后肺癌細(xì)胞的增殖能力

16、升高，而TRIM66特異性siRNA干擾明顯降低了肺癌細(xì)胞的增殖能力。集落形成實(shí)驗(yàn)取得了相似的結(jié)果，TRIM66轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞形成的集落數(shù)目增加，而TRIM66特異性siRNA干擾明顯降低肺癌細(xì)胞形成的集落數(shù)目。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:TRIM66干擾后細(xì)胞的侵襲能力受到抑制而TRIM66質(zhì)粒轉(zhuǎn)染則促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲能力。將經(jīng)過TRIM66轉(zhuǎn)染以及干擾的肺癌細(xì)胞用順鉑進(jìn)行處理，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析其凋亡水平變化，結(jié)果表明:與對照組

17、相比，轉(zhuǎn)染TRIM66質(zhì)粒后，由順鉑誘導(dǎo)的凋亡率明顯降低;而干擾TRIM66后，由順鉑誘導(dǎo)的凋亡率明顯增加。3、TRIM66通過TGF-β/Smad2/EMT級聯(lián)信號通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的惡性生物學(xué)行為。我們通過Western blot以及免疫熒光方法檢測與細(xì)胞增殖，侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TRIM66后，肺癌細(xì)胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表達(dá)量上調(diào)，E-cadherin和ZO-1表達(dá)量下調(diào)。相

18、反干擾TRIM66后，肺癌細(xì)胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表達(dá)量下調(diào)，E-cadherin和ZO-1表達(dá)量上調(diào)。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)TRIM66能夠調(diào)節(jié)Smad2的磷酸化水平（圖3）。TRIM66表達(dá)增加，p-Smad2升高;TRIM66表達(dá)下降，p-Smad2表達(dá)降低。接下來，我們應(yīng)用TGF-β抑制劑來驗(yàn)證TRIM66促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT是否依賴于TGF-β/smad通路。在沉默了TRIM66的H129

19、9細(xì)胞中加入TGF-β抑制劑SB431542，濃度為10μM，作用時(shí)間為10小時(shí)，結(jié)果顯示，抑制TGF-β/smad通路能夠減弱TRIM66引起的EMT改變，提示TRIM66可能依賴TGF-β/smad通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論:本研究證實(shí)了TRIM66在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)增加并與腫瘤較高的TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后情況顯著正相關(guān)。此外，還證實(shí)了TRIM66作為原癌基因在肺癌細(xì)胞系中促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵