ACSS2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：
　　本研究擬鑒定ACSS2基因在非小細(xì)胞肺癌癌組織及正常支氣管肺組織中的表達(dá)情況，通過(guò)siRNA干擾技術(shù)抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中ACSS2基因的表達(dá)，觀察通過(guò)靶向沉默ACSS2對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549體外增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為的影響，探討ACSS2在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為ACSS2后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供新的依據(jù)，為非小細(xì)胞肺癌的診療提供新思路新策略。
　　資料與方法：
　　收集診斷明確的非小細(xì)胞肺

2、癌患者手術(shù)切除的癌組織及正常肺組織標(biāo)本，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2基因的表達(dá)情況。通過(guò)化學(xué)合成方法設(shè)計(jì)并合成ACSS2-siRNA，在脂質(zhì)體(Lipofectamine'rM2000)的介導(dǎo)下進(jìn)行人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染。采用qRT-PCR的方法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞中ACSS2基因相對(duì)表達(dá)的量的變化。通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌

3、A549細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)ACSS2-siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞體外遷移侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.非小細(xì)胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2的表達(dá)情況
　　應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示77％（23/30）的癌組織中ACSS2呈高表達(dá)，與正常的支氣管肺組織中ACSS2的表達(dá)情況相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（

4、P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA靶向沉默ACSS2 mRNA表達(dá)
　　通過(guò)脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)將體外合成的ACSS2-siRNA及control-siRNA(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染入非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)染后的72h應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞中ACSS2基因的變化，結(jié)果表明ACSS2-siRNA可有效抑制ACSS2的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　

5、　3．轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
　　應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 ACSS2-siRNA、對(duì)照組siRNA后的A549細(xì)胞及空白對(duì)照組A549細(xì)胞在24、48、72、96小時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(8.5±5.2)％，48h細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為（17.3±3.6)％，72h細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(22.9±4.1)％，96h細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為（29.7±6.5

6、）％。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.06），48、72、96小時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率有明顯差異且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，表明通過(guò)降調(diào)ACSS2可明顯抑制細(xì)胞的增殖(圖3)。
　　4．轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：siACSS2轉(zhuǎn)染后48h，ACSS

7、2-siRNA轉(zhuǎn)染組較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率明顯上升。早期細(xì)胞凋亡率三組分別為（21.6±2.92）％，(5.7±2.51)％,（8.5±1.60）％。通過(guò)轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的早期凋亡率無(wú)明顯差異。這一結(jié)果說(shuō)明降調(diào)ACSS2能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞發(fā)生早期凋亡（圖4）。
　　5．轉(zhuǎn)染ACSS2-siR

8、NA對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲力的影響
　　應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACSS2-siRNA對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果應(yīng)用Image-Pro plus6.0進(jìn)行分析，分別測(cè)量0h、24h及其48h的劃痕寬度，平均遷移距離＝（0h的劃痕寬度－24h/48h的劃痕寬度）/2。24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均遷移（32.6±5.8） um，陰性對(duì)照組細(xì)胞平均遷移（44.6±8.4） um，空白對(duì)照組細(xì)胞平均遷移（42.9±8.0）um。三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義（P＞0.05,P=0.87）。48h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均遷移（83.1±7.7）um，陰性對(duì)照組細(xì)胞平均遷移（120.3±8.3）um，空白對(duì)照組細(xì)胞平均遷移（125.5±7.6）um。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組細(xì)胞遷移距離有明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　非小細(xì)胞肺癌癌組織中ACSS2 mRNA較正常肺組織呈明顯高表達(dá)，ACSS2-siRNA能特異性抑制ACSS2基因的表達(dá)。降調(diào)ACSS2表達(dá)可抑制非