DENND2D抑制非小細(xì)胞肺癌增殖能力和致瘤性的研究.pdf

1、背景:本實(shí)驗(yàn)室曾利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)對比了肺癌與癌旁組織差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)DENND2D基因在肺癌中低表達(dá)。但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于DENND2D的功能報(bào)道。
　　 目的:本課題旨在發(fā)現(xiàn)DENND2D在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)規(guī)律以及在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能。
　　 方法:利用半定量PCR方法比較了15例原代培養(yǎng)的支氣管上皮

2、細(xì)胞株(primarycultured bronchial epithelial cell strains， PBEs)、永生化支氣管上皮(immortalizedhuman bronchial epithelial， IHBE)細(xì)胞以及27對肺癌/癌旁組織的DENND2DmRNA表達(dá)水平。檢測了9株非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)細(xì)胞系DENND2D基因DNA拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)水平以及

3、蛋白表達(dá)水平。利用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry， IHC)的方法檢測了97例肺癌病人肺癌組織/癌旁組織的DENND2D蛋白表達(dá)水平，并利用Fisher精確檢驗(yàn)對比了兩者之間的表達(dá)差別。利用細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)以及軟瓊脂凝膠集落形成實(shí)驗(yàn)檢測了DENND2D對肺癌細(xì)胞增殖的影響。利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測了DENND2D對肺癌細(xì)胞成瘤性的影響。接著我們利用Western blot技術(shù)以及流式細(xì)胞儀技術(shù)(fluore

4、scence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)檢測了過表達(dá)DENND2D肺癌細(xì)胞系凋亡的變化情況。最后我們利用CCK-8檢測了外源過表達(dá)DENND2D的H1299細(xì)胞系經(jīng)過化療藥物順鉑處理后細(xì)胞存活的IC50值的變化，并利用Western blot技術(shù)檢測了外源過表達(dá)DENND2D的H1299細(xì)胞順鉑敏感基因PARP1以及PARP1的DNA修復(fù)功能標(biāo)志物蛋白PAR的表達(dá)量。
　　 結(jié)果:DENND2D m

5、RNA在PBEs中高表達(dá)(15/15)，但在IHBE(3/3)和NSCLC細(xì)胞系(8/9)中均為低表達(dá)。在NSCLC細(xì)胞系中，DNA拷貝數(shù)也出現(xiàn)降低(6/9)。與癌旁組織相比，肺癌組織中的DENND2D mRNA表達(dá)水平(13/27)與蛋白表達(dá)水平(23.6％ vs81.5％，p＜0.001)均顯著下調(diào)。IHC數(shù)據(jù)顯示DENND2D在腫瘤組織(IRS=0.90)以及癌前病變組織(IRS=1.38)的蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(IRS=

6、1.97)。功能上講，過表達(dá)DENND2D的NSCLC細(xì)胞系其細(xì)胞增殖能力、集落形成能力以及錨定非依賴生長能力均受到抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明DENND2D可以抑制肺癌細(xì)胞腫瘤形成能力。接下來我們檢測了凋亡標(biāo)志物cleaved PARP，其表達(dá)量在外源過表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。FACS的數(shù)據(jù)也顯示外源過表達(dá)的細(xì)胞凋亡率顯著上升，并與DENND2D表達(dá)水平呈正相關(guān)。CCK-8檢測順鉑處理的DENND2D過表達(dá)H1299細(xì)胞存活數(shù)據(jù)顯示，相對于

7、對照組，其IC50(50％ inhibiting concentration)值顯著降低。同時(shí)外源過表達(dá)DENND2D的H1299細(xì)胞PARP1和PAR的表達(dá)顯著降低。
　　 結(jié)論:DENND2D的低表達(dá)調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，同時(shí)其低表達(dá)在肺癌腫瘤形成過程中是一個(gè)早期事件。在NSCLC細(xì)胞增殖和致瘤性兩方面DENND2D均扮演著重要角色。其在NSCLC細(xì)胞中的功能主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)凋亡和增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞順鉑細(xì)胞毒性敏感性。
　

8、　 實(shí)驗(yàn)背景:本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Brk1基因在參與Rac-Arp2/3的信號傳導(dǎo)中具有較為重要的生物學(xué)地位，其異常表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能的重要因素之一。目前有關(guān)HSPC300起始密碼子上游的基因結(jié)構(gòu)，順式調(diào)控元件，以及相應(yīng)的反式作用因子等均不清楚。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?在轉(zhuǎn)錄水平了解引發(fā)HSPC300基因高表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，為腫瘤細(xì)胞如何獲得轉(zhuǎn)移潛能提供更深層次的分子機(jī)理，為尋找控制細(xì)胞遷移運(yùn)動的靶通路提供線索。
　

9、　 實(shí)驗(yàn)方法:利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件對Brk1基因5'側(cè)翼區(qū)7KB范圍進(jìn)行預(yù)測，找到轉(zhuǎn)錄因子相對集中的區(qū)域，利用正常人類基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增并測序。利用此為模板，對其分段擴(kuò)增，并將上述片段克隆到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中成為重組質(zhì)粒，并利用熒光素酶雙報(bào)告基因平臺檢測其轉(zhuǎn)錄活性。利用截短法逐步截短活性強(qiáng)的片段，利用片段熒光素酶活性的改變找到Brk1基因核心啟動子區(qū)所處位置。利用表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)篩選出非小細(xì)胞肺癌中與轉(zhuǎn)移相關(guān)并與Brk1基因

10、表達(dá)呈正相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，與候選Brk1基因核心啟動子區(qū)片段熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測熒光素酶活性是否增高。同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件對候選Brk1基因核心啟動子區(qū)進(jìn)行分析，找到轉(zhuǎn)移相關(guān)候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，將其突變，并檢測其熒光素酶活性是否降低。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:我們利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件TFsearch和MATCHTM對Brk1基因5'側(cè)翼區(qū)7KB范圍進(jìn)行預(yù)測，找到了轉(zhuǎn)錄因子相對集中的上游4.5KB區(qū)域并進(jìn)行了擴(kuò)增，測序

11、結(jié)果顯示與GenBank序列完全比對。分段擴(kuò)增得到片段F1、F3、F5和F8，經(jīng)過測序也與GenBank完全比對。雙熒光素酶雙報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示片段F3和F8以及全長熒光素酶活性均顯著增強(qiáng)，其中片段F3弱于片段F8。利用熒光素酶雙報(bào)告基因檢測片段F3和F8的截短體，發(fā)現(xiàn)了位于-3661-3212區(qū)段的候選弱啟動子，位于-1314-934區(qū)段的候選增強(qiáng)子，位于-94-1（片段S831）區(qū)段的候選核心啟動子區(qū)。通過對mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)

12、的分析，我們找到了8個(gè)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與Brk1基因表達(dá)呈正相關(guān)的候選轉(zhuǎn)錄因子。與片段S831共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)在A549和H1299細(xì)胞中Jun能顯著增強(qiáng)S831的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)倍數(shù)分別為3.90倍和3.56倍。候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sp1結(jié)合位點(diǎn)(-78-74)突變后S831片段的轉(zhuǎn)錄活性大大降低，在三株細(xì)胞中均降低90％以上。
　　 結(jié)論:起始密碼子上游-78-74區(qū)段是Brk1基因核心啟動子區(qū)，Sp1蛋