伊班膦酸鈉對小細(xì)胞肺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，觀察骨吸收抑制劑(伊班膦酸鈉)對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床應(yīng)用骨吸收抑制劑治療溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤提供新的思路和依據(jù)。 方法：1腫瘤組織的取材臨床中選擇肺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的患者，共計(jì)6例，其中取自股骨轉(zhuǎn)子間轉(zhuǎn)移灶4例，椎體轉(zhuǎn)移灶2例。術(shù)前未經(jīng)任何治療(主要指放、化療等抗腫瘤治療)，于術(shù)中無菌條件下切取轉(zhuǎn)移灶實(shí)體腫瘤組織塊，立即浸入無血清培養(yǎng)液保鮮，并迅速進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將獲得的組織材料在無菌條件

2、下剪切成約1～2mm3小組織塊，用0.25％胰蛋白酶消化液在4℃環(huán)境下進(jìn)行冷消化12～24小時，離心后去除上清液，再次加入0.25％胰蛋白酶消化液，置37℃溫箱中溫?zé)嵯?0～30分鐘，將得到的組織與細(xì)胞懸液通過100目孔徑的不銹鋼濾網(wǎng)濾過，離心后去除胰蛋白酶并用細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗1～2次，然后離心去上清，制備成最終的細(xì)胞懸液。2細(xì)胞培養(yǎng)、篩選及純化將最終制備的細(xì)胞懸液按5×105～1×106個/ml細(xì)胞計(jì)數(shù)接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入

3、pH值為7.0～7.2的RPMI 1640培養(yǎng)液4ml(內(nèi)含終濃度為100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)置于37℃、5％CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，約2～4天細(xì)胞開始貼壁生長后，依據(jù)不同細(xì)胞對胰蛋白酶消化液的不同耐受時間以及差異離心的方法將原代培養(yǎng)的混雜生長細(xì)胞進(jìn)行分離、純化，去除成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，獲得所需的腫瘤細(xì)胞。3 實(shí)驗(yàn)分組將處于對數(shù)生長期的骨轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞按1×104個/ml的濃度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上于培

4、養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長完全覆蓋孔底后，設(shè)為試驗(yàn)組和對照組兩組，對照組加入同等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.9％NaCl，試驗(yàn)組加入不同濃度(2、4、8μg/ml)的伊班膦酸鈉。4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡觀察不同濃度和/或不同作用時間細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的差異。5觀察細(xì)胞對骨磨片的作用將預(yù)先制備厚約50～100μm、面積約4×4mm2大小的骨磨片與空白組和對照組的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，于7、10天后，倒置相差顯微鏡觀察不同濃度和/或不同作用時聞骨磨片吸收陷窩

5、數(shù)目及形態(tài)學(xué)的差異。6 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)采用MTT法檢測伊班膦酸鈉對溶骨性骨轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞增殖抑制情況，并測定期吸光度(OD)值，從而計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=(1-A試驗(yàn)組/A對照組)×100％。7測定細(xì)胞生長曲線按1×104個/孔的濃度將單細(xì)胞懸液接種子96孔培養(yǎng)板中，按照實(shí)驗(yàn)分組分別計(jì)入0.9％NaCl。和不同濃度的伊班膦酸鈉溶液，每組設(shè)3個復(fù)孔，每24小時取3孔進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，連續(xù)7天，繪制細(xì)胞生長曲線。8流式細(xì)胞術(shù)分析應(yīng)用美國B.D公司的

6、FACS-420流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)不同濃度伊班膦酸鈉溶液作用48小時后腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期，以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2與bax的表達(dá)。 結(jié)果：1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，可見空白組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞密度較大，相互連接，呈梭形或不規(guī)則多邊形。細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清。高倍鏡下可部分細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核隱約可見，胞漿內(nèi)顆粒含量少。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞折光性減弱，輪廓增強(qiáng)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，脂滴等顆粒樣物質(zhì)

7、。細(xì)胞失去原有形態(tài)，貼壁性減弱，培養(yǎng)液中漂浮細(xì)胞數(shù)目和崩解的細(xì)胞碎片明顯增多，且有明顯時間及濃度梯度依賴。2 觀察細(xì)胞對骨磨片的作用倒置相差顯微鏡下可見空白組中的骨磨片吸收陷窩較多、較深，相互連接成片，呈現(xiàn)梅花狀、串珠狀，而試驗(yàn)組骨磨片骨吸收陷窩形成減慢，數(shù)量減少，陷窩多呈單個圓形，難以連接成片，同樣存在時間和濃度梯度依賴性。3 細(xì)胞增值抑制試驗(yàn)采用MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率，顯示在初始接種等量細(xì)胞數(shù)目的前提下，空白組MTT結(jié)晶物多于各

8、試驗(yàn)組，測定其吸光度(OD)值高于試驗(yàn)組，而試驗(yàn)組則呈現(xiàn)隨濃度梯度逐漸下降的趨勢，其細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高。4測定細(xì)胞生長曲線根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制出細(xì)胞生長曲線，顯示空白組細(xì)胞生長曲線接近于正常，可見典型的滯留期、指數(shù)生長期和平臺期，不同濃度試驗(yàn)組細(xì)胞生長曲線在滯留期過后未見明顯的指數(shù)生長期和平臺期，較早出現(xiàn)下降曲線，且與藥物濃度增加有相關(guān)性。5細(xì)胞凋亡率變化流式細(xì)胞儀檢測顯示，在相同的作用時間前提下，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)4μg/ml伊班膦酸鈉處理

9、的細(xì)胞，其48小時細(xì)胞凋亡率為30.14％±2.33，而空白組細(xì)胞凋亡率為3.78％±1.18，并且隨著伊班膦酸鈉濃度的不斷增加，細(xì)胞凋亡率也隨之增加；在相同藥物濃度的前提下，隨著作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)遞增趨勢，而空白組細(xì)胞凋亡率的變化不明顯?？瞻捉M與試驗(yàn)組相比較，差異有顯著性(P＜0.05)，顯示伊班膦酸鈉在體外能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。6細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析表明，經(jīng)4μg/ml伊班膦酸鈉處理的試驗(yàn)組細(xì)

10、胞處于G0/G1期和S期細(xì)胞分布百分率分別為71.21％±6.68和12.1％±1.19，空白組分別為57.4％±5.32和27.5％±3.01。2μg/ml試驗(yàn)組細(xì)胞處于G0/G1期和S期細(xì)胞分布百分率分別為64.50％±5.21和16.61％±3.22。8μg/ml試驗(yàn)組細(xì)胞處于G0/G1期和S期細(xì)胞分布百分率分別為78.4％±7.28和6.71％±1.98?？瞻捉M與各試驗(yàn)組相比較(P＜0.05)，分布百分率差異有顯著性。G2/M期

11、細(xì)胞分布百分率則相反，不同藥物濃度試驗(yàn)組細(xì)胞在此期內(nèi)細(xì)胞分布百分率逐漸減少，空白組細(xì)胞分布百分率相對穩(wěn)定。7測定Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)量流式細(xì)胞儀間接熒光發(fā)檢測Bcl-2蛋白和Bax蛋白基因表達(dá)相對含量，各濃度試驗(yàn)組處理小細(xì)胞肺癌細(xì)胞48小時后均使Bcl-2蛋白表達(dá)相對含量FI≤1.0(即陰性表達(dá))，隨著作用計(jì)量的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)相對含量逐漸降低，空白組無此變化。試驗(yàn)組與空白組相比較(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試驗(yàn)組