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文檔簡介
1、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是多角體桿狀病毒科的典型代表,能感染30多種鱗翅目昆蟲,該病毒的基因組是由大小為134kb的環(huán)狀單一雙鏈DNA分子組成。感染宿主后的核型多角體病毒有兩種表型:一種為包涵體病毒(ODV),另一種則為非包涵體病毒(BV)。目前只在BV顆粒中發(fā)現(xiàn)Gp64蛋白,分子量為6 kD。Gp64蛋白是第三類過濾性的膜融合蛋白,主要以二硫鍵相連三聚體的形式存在于桿狀病毒BV的一端,在病毒感染的早期和晚期均能表達(dá)這
2、個蛋白,它是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵功能蛋白之一。Gp64蛋白作為桿狀病毒BV上的囊膜蛋白,在內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞中,對結(jié)合宿主細(xì)胞受體和調(diào)節(jié)低 pH引發(fā)膜融合有重要作用。同時Gp64蛋白也是病毒萌芽和后代產(chǎn)生所必需的。本實驗將Gp64基因克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中,得到重組Gp64蛋白,利用純化的Gp64蛋白通過免疫大白兔實驗獲得了Gp64蛋白抗體,用來檢測Gp64基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。
1.苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64基因在大
3、腸桿菌中的表達(dá):以AcMNPV Bacmid質(zhì)粒為模板,參照NCBI上所給出的Gp64蛋白基因組序列,設(shè)計一對引物,并在其上下游分別添加EcoR I和Sal I酶切位點。PCR擴增出全長的Gp64基因。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后用EcoR I和Sal I酶切后與經(jīng)EcoR I和Sal I酶的同尾酶Xba I酶同樣處理的pET28a(+)原核表達(dá)載體連接,命名pET28a-Gp64。挑取陽性克隆,抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后,轉(zhuǎn)化到
4、于E.coli野生型BL21表達(dá)菌中,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測Gp64蛋白基因在大腸桿菌中沒有表達(dá)。
2.苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒截短Gp64基因在大腸桿菌中的表達(dá):以AcMNPV Bacmid質(zhì)粒為模板,參照NCBI上給出的Gp64全基因組序列及已報到跨膜區(qū)域的相關(guān)序列來切除下游跨膜區(qū)域以確定截短序列。采用與之前相同的方法設(shè)計引物,添加相同的酶切位點,PCR擴增后得到截短Gp64基因,PCR產(chǎn)物和pE
5、T28a(+)原核表達(dá)載體通過酶切后進(jìn)行連接反應(yīng),重組子命名為pET28a-截短Gp64。挑取陽性克隆,抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后,轉(zhuǎn)化到于E.coli野生型BL21表達(dá)菌中用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測Gp64基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白大小約為40kD。對目的蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,對收獲的目的蛋白進(jìn)行電透析純化,得到純度較高的目的蛋白,割膠免疫大白兔,收獲Gp64蛋白抗體。
3.苜蓿銀紋夜蛾核型多角體
6、病毒Gp64基因在釀酒酵母中的表達(dá):以AcMNPV Bacmid質(zhì)粒為模板,參照NCBI上給出的Gp64蛋白基因組序列,設(shè)計一對引物,并在其上下游添加了EcoR I和Sal I酶切位點,PCR擴增后得到Gp64基因。所得的PCR產(chǎn)物用EcoR I和Sal I酶切后與經(jīng)相同酶處理的pGBKT7酵母表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng),得到的重組子命名 pGBKT7-Gp64。挑取陽性克隆,抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后,轉(zhuǎn)化到于釀酒酵母表達(dá)菌AH109
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