BmNPV da26基因及gp64融合表達(dá)抗腫瘤藥物L(fēng)-天冬酰胺酶Ⅱ.pdf

1、桿狀病毒是大型的雙鏈DNA病毒，主要感染昆蟲(chóng)，該病毒作為重要的基因工程載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞或蟲(chóng)體中表達(dá)外源蛋白，通過(guò)極晚期基因的啟動(dòng)子polh或p10可使外源蛋白高水平表達(dá)。家蠶桿狀病毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的da26基因產(chǎn)物(BV/ODV-E26)是一種包膜蛋白，可以包被于多角體的外膜表面。本研究利用da26基因融合表達(dá)外源基因，使外源表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合于病毒顆粒，通過(guò)超聲裂解和差速離心法

2、將外源蛋白分離純化。L-天冬酰胺酶Ⅱ（L-asparagine enzymeⅡ，L-ASP）是一種酰胺基水解的酶類(lèi)藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。目前，主要采用大腸桿菌生產(chǎn)的L-ASP產(chǎn)品。但由于可能污染內(nèi)毒素等原因，存在一定的安全隱患。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)冒踩臈U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)L-ASP。通過(guò)基因重組技術(shù)，構(gòu)建桿狀病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastdual-Pph-polh-Pp10-da26-asp（全長(zhǎng)）以及pFastd

3、ual-Pph-polh-Pp10-da26-asp(s)（成熟肽），獲得表達(dá)L-ASP全長(zhǎng)以及成熟肽的重組家蠶桿狀病毒，感染家蠶細(xì)胞后進(jìn)行表達(dá)。
　　GP64是桿狀病毒核型多角體病毒組Ⅰ的主要囊膜糖蛋白，它的結(jié)構(gòu)可以在病毒粒子(Budded virus，BV)表面展示外源蛋白。本研究通過(guò)BmNPV的囊膜糖蛋白GP64的表面展示元件，在病毒粒子表面展示L-ASP成熟肽，探討表面展示的BV作為抗腫瘤藥物的可行性。
　　構(gòu)建表面

4、展示的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacdual-Pp10-gp64sp-asp(s)-gp64ctd，轉(zhuǎn)化含BmNPV基因組的大腸桿菌E.coli DH10BacTM，通過(guò)藍(lán)白斑篩選發(fā)生重組的克隆，獲得重組桿粒DNA。將重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，獲得重組病毒，感染BmN細(xì)胞，收集感染的病毒液，進(jìn)行BV的超速離心純化。檢測(cè)表達(dá)融合L-ASP的酶活性，并通過(guò)Western blot驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)。
　　與da26基因融合表達(dá)的L-

5、ASP全長(zhǎng)、成熟肽的酶活性分析結(jié)果表明，融合全長(zhǎng)L-ASP的活性為2113.52 U/mg，融合成熟肽的表達(dá)活性為2279.87 U/mg，說(shuō)明融合表達(dá)的L-ASP均具有活性。但細(xì)胞內(nèi)多角體的數(shù)量較少，對(duì)總體產(chǎn)量和產(chǎn)品純化有影響。與gp64基因融合表達(dá)的L-ASP在細(xì)胞中的活性為1788.4U/mg，Western blot檢測(cè)到純化后的BV含L-ASP蛋白，但純化的BV液中檢測(cè)不出L-ASP酶活性，表明構(gòu)建的桿狀病毒GP64展示系統(tǒng)可