N-端聚乙二醇化L-門冬酰胺酶的制備、純化及鑒定研究.pdf

1、左旋門冬酰胺酶(L-ASP)是一種白色或微黃色凍干粉未，無嗅、無味，由4個(gè)亞基組成的同型四聚體，其相對(duì)分子量為133000±5000，主要作用是把血清中的門冬酰胺水解為門冬氨酸和氨，臨床上主要用于治療急性淋巴細(xì)胞性白血病(簡稱急淋)。急性白血病等腫瘤細(xì)胞會(huì)因既不能從血中取得足夠門冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白質(zhì)合成受障礙，增殖受抑制，細(xì)胞大量破壞而不能生長、存活；正常細(xì)胞有自身合成門冬酰胺的功能而不受影響。本品亦能干擾細(xì)胞DNA、RN

2、A的合成，可能作用于細(xì)胞G1增殖周期中。在臨床應(yīng)用上，重組L-ASP與其它的重組制品一樣具有半衰期短、有較強(qiáng)的免疫原性、毒副作用大等缺點(diǎn)。由于體內(nèi)半衰期較短，需要每天注射才能維持有效的血藥濃度。結(jié)果長期而頻繁的注射，增加了治療成本，給患者帶來嚴(yán)重的痛苦和不便，降低了依從性，加重了病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 為了克服L-ASP在臨床用藥上的限制，本課題選擇單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)對(duì)左旋門冬酰胺酶(L-ASP)進(jìn)行N-末端定位

3、修飾，通過增大其分子量，降低腎臟消除率，提高藥物體內(nèi)半衰期；偶聯(lián)PEG的立體屏蔽效應(yīng)，減緩了胰蛋白酶的降解，同時(shí)也使其免疫原性大大降低；由于PEG的生物相容性好、藥物半衰期的延長，可以減少用藥次數(shù)，也相應(yīng)的降低了其毒副作用。 本課題具體研究內(nèi)容如下： 一、通過對(duì)PEG修飾反應(yīng)的主要影響因素摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值的篩選，建立了一種優(yōu)化的PEG-L-ASP的制備及純化工藝，其優(yōu)化的修飾條件為L-ASP：mPE

4、G=1：10，溫度37℃，時(shí)間6h，pH=5.0，酶溶液濃度為5.0mg/ml，該優(yōu)化條件下L-ASP的修飾轉(zhuǎn)化率為87.94﹪；建立了離子交換色譜和凝膠過濾色譜聯(lián)用的分離純化工藝，并用其分離純化了優(yōu)化修飾條件下制備的PEG-L-ASP，得到了修飾產(chǎn)物均一、且純度在95﹪以上的修飾酶。 二、為了考察修飾產(chǎn)物PEG-L-ASP的理化性質(zhì)及確證其一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用紫外掃描、IEF電泳、熒光胺法測修飾度、WesternBlot免疫印跡、肽

5、圖分析等方法對(duì)偶聯(lián)終產(chǎn)物PEG-L-ASP進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化后的PEG-L-ASP的效價(jià)為134.076單位/mg，而L-ASP原酶的效價(jià)為373.670單位/mg，其修飾酶的活性保留為原酶的35.88﹪，修飾酶PEG-L-ASP與L-ASP原酶的最大吸收峰一樣都在278nm的位置，等電點(diǎn)也都位于4.65～4.75之間，獲得修飾酶PEG-L-ASP的PEG化率為3.27﹪，PEG-L-ASP修飾帶與L-ASP未修飾帶在Weste

6、rnBlot免疫印跡時(shí)都呈陽性反應(yīng)，但PEG-L-ASP修飾帶與抗體結(jié)合能力很弱，初步說明其免疫原性低，胰蛋白酶肽圖分析發(fā)現(xiàn)PEG-L-ASP與L-ASP的肽譜只有一個(gè)明顯的差異峰，說明很有可能PEG-L-ASP僅N-末端被偶聯(lián)了PEG。 總之，本課題對(duì)L-ASP的PEG修飾工藝、分離純化工藝及偶聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證、理化性質(zhì)的研究，為PEG-L-ASP申報(bào)國家一類新藥提供了初步的理論依據(jù)，對(duì)加速PEG-L-ASP的臨床化應(yīng)用有著重