新型聚乙二醇化葡激酶的制備及功能鑒定研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)葡激酶（SAK）基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變、表達(dá)、純化與進(jìn)行聚乙二醇修飾以獲得較高純度的聚乙二醇化葡激酶（peg-SAK-cys）,并對(duì)其溶栓活性與免疫原性初步進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法：設(shè)計(jì)引物將根據(jù)SAK晶體結(jié)構(gòu)與預(yù)測(cè)抗原位點(diǎn)所挑選的82號(hào)氨基酸突變?yōu)榘腚装彼岵⑼蛔冑|(zhì)粒通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)。利用經(jīng)典原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)突變葡激酶蛋白(SAK-cys)。利用鎳離子交換柱、分子篩等方法分離純化SAK-cys蛋白并

2、對(duì)其進(jìn)行聚乙二醇修飾。用纖維蛋白平板溶圈法和血栓彈力圖初步對(duì)本次實(shí)驗(yàn)制備的peg-SAK-cys與課題組以相同方法制備的另外4種peg-SAK-cys的生物活性進(jìn)行驗(yàn)證。以酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法評(píng)價(jià)這些peg-SAK-cys的免疫原性。分析體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并對(duì)功能評(píng)價(jià)較高的 peg-SAK-cys通過(guò)動(dòng)物栓塞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步功能驗(yàn)證。
　　結(jié)果：成功獲得了82號(hào)氨基酸突變的葡激酶質(zhì)粒，表達(dá)、純化了突變蛋白，并進(jìn)行聚乙二醇修飾獲得

3、了第82號(hào)葡激酶突變的葡激酶蛋白（peg-SAK-C82A），分離純化后純度在總蛋白質(zhì)量的90%以上。統(tǒng)計(jì)分析與計(jì)算溶圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第97號(hào)與104號(hào)氨基酸突變的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-C97A、peg-SAK-C104G）保留了較高的活性；血栓彈力圖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也支持了這一結(jié)果；免疫原性測(cè)定結(jié)果提示peg-SAK-C104G的免疫原性顯著低于野生型SAK（P=0.0002）；評(píng)價(jià)peg-SAK-C104G對(duì)SD大鼠頸動(dòng)脈栓塞模型的