2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   我們以往的研究發(fā)現(xiàn),在E-cadherin的情況下p120ctn能夠影響肺癌細胞的侵襲和增殖能力,而且我們還發(fā)現(xiàn)p120ctn-1能夠上調(diào)β-catenin,而p120ctn-3卻不能,因此我們推測p120ctn-1A與3A影響肺癌細胞增殖的機制很可能是不同的。D120ctn-1很可能是通過β-catenin激活經(jīng)典的WNT通路影響細胞的增殖,而D120ctn-3則很可能通過其他的因素而影響肺癌細胞的增殖。盡管已有

2、文獻報道p120ctn-3具有抑制細胞周期的作用,但p120ctn-3影響細胞周期的真正的分子機制還不十分清楚。Kaiso是作為p120ctn結(jié)合的配體而被發(fā)現(xiàn)的一種核BTB/POZ-ZF轉(zhuǎn)錄抑制因子,Kaiso能夠識別DNA啟動子上的特異性序列TCCTGCnA(即Kaiso-binding sites,KBS),抑制相應基因的表達。由于細胞周期蛋白cyclinD1啟動子中也含有KBS序列,因此很可能是其潛在的下游靶基因。有趣的是,Ka

3、iso與p120ctn的結(jié)合部位-鋅指結(jié)構恰恰也是它與KBS序列的結(jié)合部位。因此,我們設想:p120ctn-3很可能通過與Kaiso的結(jié)合,影響了Kaiso與KBS的結(jié)合,并影響KaisoN的核/漿分布,從而影響cyclinD1的轉(zhuǎn)錄,進而影響細胞周期。因此,我們通過過表達和干擾p120ctn,以及過表達和敲除Kaiso,分別探討p120ctn-1A和3A通過Kaiso對肺癌細胞增殖和周期的影響。
   方法:
   1

4、、細胞培養(yǎng)
   肺腺癌SPC細胞系、A549細胞系購自ATCC。SPC和A549細胞分別在含有10%胎牛血清(GBICO Inc.,NY,USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(GBICO Inc.,NY,USA)和含有10%胎牛血清(GBICO Inc.,NY,USA)的DMEM培養(yǎng)基(GBICO Inc.,NY,USA)中培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。
   2、四甲基偶氮唑鹽(tetrazolium,MTT)法檢測細胞

5、增殖能力
   取對數(shù)生長期的肺癌細胞懸液進行細胞計數(shù),分別接種于4個96孔板培養(yǎng)板。接種24小時后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時分別加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續(xù)孵育4小時后,每孔加入150μlDMSO溶解結(jié)晶,選擇波長550nm在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。
   3、流式細胞儀檢測細胞周期
   收集對數(shù)生長期細胞制成1×107個/ml細胞懸液。取1ml細胞

6、懸液75%冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制成500 μl的細胞懸液,加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機檢測,ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。
   4、RT-PCR
   轉(zhuǎn)染48h后收集細胞,用Trizol Reagent(Invitrogen,CA,USA)提取后細胞的總RNA,具體操作步驟按說明書進行。用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa Biotechnolo

7、gy Co.,Japan)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,分別擴增Kaiso、β-catenin、cyclinD1、cyclinE,以β-actin為內(nèi)參。用 NIH image 軟件分析產(chǎn)物條帶灰度,以目的產(chǎn)物條帶灰度值與 β-actin產(chǎn)物條帶灰度值的比值作為mRNA的相對表達量。
   5、Western blot
   收集細胞,提取總蛋白,蛋白定量。收集足量目的細胞,用皮爾斯公司核漿分離試劑盒

8、,具體步驟按說明書嚴格進行,分別提取核/漿蛋白,蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,然后用3%小牛血清封閉,一抗4℃孵育過夜,二抗37℃孵育2小時后ECL發(fā)光,曝光膠片后,蛋白條帶經(jīng)BioImaging Systems(UVP,CA,USA)采集后進行灰度值測定,目的蛋白灰度值與內(nèi)對照β-actin進行標準化后即為其相對蛋白定量。
   6、ChIP
   在GENEBANK中查找出cyclinD1啟動子基因序列(

9、GenBank:AY439218.1),設計相應含有KBS序列的啟動子片段引物(委托TAKARA公司完成),上游:5'-CCCT CTCATGTAACCACGAA-3’,下游:5’-TGGTTTTGTTGGGGGTGTAG-3’,退火55癌℃,擴增片段為179bp。用Upstate公司ChIP試劑盒,具體步驟按說明書進行。RT-PCT檢測最終目的片段。
   7、免疫熒光染色
   接種細胞于24孔板中,PBS沖洗三次。

10、4%的多聚甲醛于冰上固定,PBS沖洗三次。洗過后用0.2%的triton-X100于常溫打孔15-30分鐘,PBS沖洗三次。打孔后用1%的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后棄去封閉液加入一抗,p120ctn(1:200)和Kaiso羊多抗(1:100),4℃孵育過夜。PBS沖洗三次,在暗室中加入羊抗鼠二抗FITC(1:100),室溫孵育1個小時,用PBS沖洗后,加入兔抗羊二抗TRITC(1:100),室溫孵育1個小時,PBS沖洗后,加入H

11、oechst1:200稀釋于PBS中,室溫孵育3分鐘,PBS沖洗后,用熒光顯微鏡觀察。
   8、免疫共沉淀
   提取的蛋白中加入4μg的誘餌蛋白抗體,充分混勻后4℃孵育2小時后加入25μl Protein G Microbeads,混勻后繼續(xù)4℃孵育1小時。按照操作說明步驟,混合液過μ柱,SDS上樣緩沖液沖洗μ柱,收集免疫共沉淀產(chǎn)物,Western blot進行檢測。
   9、統(tǒng)計分析
   使用S

12、PSS13.0統(tǒng)計軟件進行結(jié)果統(tǒng)計。所有以均數(shù)±標準差(X±SD)表示的數(shù)據(jù),其實驗至少重復3次,使用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis test統(tǒng)計Western blot、RT-PCR、MTT assay、細胞周期及ChIP的結(jié)果。P值<0.05具有統(tǒng)計學意義。
   結(jié)果:
   在A549和SPC細胞中,干擾總p120ctn細胞增殖能力顯著降低,分別回復p120ctn-1和3亞型

13、后均有效的回復了細胞的增殖能力;在A549和SPC細胞中,干擾總p120ctn,細胞G0/G1期細胞比例增高,S期細胞比例顯著降低,分別回復p120ctn-1A或p120ctn-3A后,SPC-K2的G0/G1期細胞比例均明顯下降,S期顯著升高:在A549和SPC細胞中,p120ctn-1和3亞型均能有效上調(diào)cyclinD1和cyclinE的蛋白和mRNA水平;在SPC-K2細胞中分別瞬轉(zhuǎn)回復p120ctn-1和3亞型后,kaiso的蛋

14、白和mRNA水平?jīng)]有變化,回復p120ctn-1后B-catenin的蛋白和mRNA水平顯著上調(diào),而回復p120ctn-3后β-catenin蛋白和mRNA水平無明顯改變;ChIP證實kaiso可以與cyclinD1啟動子區(qū)的KBS序列結(jié)合;在A549和SPC細胞中,kaiso能夠有效的調(diào)控cyclinD1和cyclinE的蛋白和mRNA水平;免疫共沉淀方法檢測發(fā)現(xiàn),在A549和SPC兩種細胞系中p120ctn-3可以與kaiso結(jié)合,

15、而未能檢測出p120ctn-1與kaiso的結(jié)合;ChIP檢測在A549中過表達p120ctn-1后kaiso與cyclinD1啟動子結(jié)合情況無明顯改變,而過表達p120ctn-3后kaiso與cyclinD1啟動子結(jié)合明顯減少,幾乎檢測不到;免疫熒光和核/漿分離蛋白檢測發(fā)現(xiàn),p120ctn-3能夠有效調(diào)控kaiso的亞細胞定位,kaiso的出核依賴于p120ctn-3的出核轉(zhuǎn)運。
   結(jié)論:
   1、p120ctn

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