桿狀病毒泛素基因的進(jìn)化與BmNPV泛素基因的特性研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）為雙鏈DNA病毒，其基因組共含有143個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF），是家蠶的主要病原體。BmNPV泛素基因（ubiquitin）編碼一個(gè)由77個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白。桿狀病毒是目前已知的僅有的含有泛素基因的病毒，而在真核生物中，泛素是一個(gè)廣泛存在且十分重要的小分子蛋白，在細(xì)胞凋亡、蛋白的特異性降解、細(xì)胞分化

2、等眾多方面都有著十分重要的作用。目前對(duì)于桿狀病毒泛素基因的研究尤其是BmNPV的泛素基因(vub)的研究還較少，本研究從生物信息學(xué)，轉(zhuǎn)錄時(shí)相，表達(dá)時(shí)相，基因的敲除、拯救與替換，49種桿狀病毒與16種昆蟲(chóng)宿主泛素基因的差異與進(jìn)化等方面對(duì)BmNPV泛素做了基礎(chǔ)性的研究，為桿狀病毒泛素基因的后續(xù)研究提供了研究基礎(chǔ)，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學(xué)分析顯示，BmNPV泛素蛋白(VUB)由77個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)分子量約為8.65

3、kDa，等電點(diǎn)為6.56。該蛋白并無(wú)信號(hào)肽區(qū)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明該蛋白在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核當(dāng)中均有分布。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示VUB為一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)，包含了3個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊，該結(jié)構(gòu)與所預(yù)測(cè)的家蠶泛素蛋白三維結(jié)構(gòu)十分相似。
　　(2)通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)vub進(jìn)行分子克隆并進(jìn)行原核表達(dá)，大量誘導(dǎo)VUB的表達(dá)，并對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化切割，成功制備多克隆抗體。驗(yàn)證所制備抗體的特異性與效價(jià)較高，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
　　(

4、3)轉(zhuǎn)錄時(shí)相與表達(dá)時(shí)相分析均表明vub為極晚期基因，但是該基因在BmN細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間比在家蠶中腸組織中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間提前了約24小時(shí)。此外，表達(dá)時(shí)相分析表明，vub可能參與了家蠶細(xì)胞中的UPP途徑。三種不同品系家蠶(NB、306、BC8)中腸組織中vub的表達(dá)出現(xiàn)了比較明顯的差異，這暗示vub可能與家蠶抗病毒機(jī)制有一定的關(guān)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　(4)構(gòu)建重組Bacmid并轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過(guò)熒光報(bào)告蛋白EGFP觀察病毒的

5、轉(zhuǎn)染增殖情況，并通過(guò)TCID50分析來(lái)確定vub的缺失是否像AcMNPV泛素基因缺失一樣，導(dǎo)致BV的產(chǎn)量有大幅度下降。結(jié)果顯示，不論何種重組Bacmid，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所觀察到的熒光現(xiàn)象基本一致，并未出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明vub的缺失并不會(huì)影響病毒基因組的復(fù)制。
　　(5)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，泛素基因在昆蟲(chóng)宿主和桿狀病毒中都受到了很強(qiáng)的純化選擇壓力，且昆蟲(chóng)宿主泛素基因所受到的純化選擇壓力要比桿狀病毒泛素基因更大，即昆蟲(chóng)泛素進(jìn)化更為保守。系統(tǒng)