桿狀病毒保守基因AcMNPV ac53的研究.pdf

1、苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) ac53基因是桿狀病毒基因組中的一個(gè)高度保守但功能未知的基因。本文對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了系統(tǒng)的研究；同時(shí)利用ET—同源重組系統(tǒng)和Bac—to—Bac系統(tǒng)，構(gòu)建了ac53缺失型重組病毒，研究了ac53在病毒復(fù)制中所起的重要作用；在ac53缺失的基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，相繼構(gòu)

2、建出6株ac53點(diǎn)突變補(bǔ)回型重組病毒，對(duì)Ac53的功能進(jìn)行了深入的研究。 ac53基因位于AcMNPV基因組44，712 nt～45，131 nt之間，全長(zhǎng)420 bp，編碼140個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)編碼蛋白的分子量為16.994 kDa。在ac53起始密碼子ATG的上游存在三個(gè)典型的桿狀病毒晚期啟動(dòng)子元件TAAG。序列分析表明，Ac53的氨基酸序列在桿狀病毒中具有高度的保守性，與PlxyMNPV、RoMNPV、BmNPV、MvMN

3、PV的同源蛋白的相似性超過了90％。氨基酸序列的同源比對(duì)分析結(jié)果顯示，Ac53中存在一個(gè)潛在的鋅指環(huán)蛋白模序。 5'—RACE結(jié)果表明ac53有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，分別位于其ATG上游-15 nt～-12 nt和—45 nt～—42 nt的桿狀病毒典型晚期啟動(dòng)子模序TAAG中的第二個(gè)堿基A。PCR擴(kuò)增得到ac53全長(zhǎng)讀碼框序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pQE30上，在大腸桿菌中表達(dá)出分子量約為17 kDa的融合了六個(gè)組氨酸的His—

4、Ac53融合蛋白。以純化的His—Ac53融合蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了Ac53抗血清。免疫印跡分析表明，該抗血清能與感染AcMNPV的細(xì)胞總蛋白樣品發(fā)生特異性反應(yīng)。可檢測(cè)到大小約為20 kDa的Ac53蛋白(比預(yù)期的16.994 kDa分子量大，推測(cè)可能是由于該蛋白發(fā)生了某些翻譯后修飾所致)，且能在感染后(post—infection，p.i.)24 h被檢測(cè)出來，并一直持續(xù)到72 h p.i.。這些結(jié)果均表明ac53可能是

5、一個(gè)晚期基因。 為了研究Ac53在宿主細(xì)胞中的定位情況，我們構(gòu)建了在ac53啟動(dòng)子控制下表達(dá)Ac53GFP(Green Fluorescence Protein，GFP)融合蛋白的重組病毒vAcac53GFP。通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)vAcac53GFP感染的Sf9細(xì)胞中綠色熒光的分布情況，追蹤Ac53在宿主細(xì)胞中的位置變化。研究結(jié)果表明，在12 h p.i.，融合蛋白出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中；24 h p.i.時(shí)，融合蛋白分布在整個(gè)細(xì)胞

6、中；48 h p.i.到72 h p.i.，融合蛋白最終定位于緊靠核外膜的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。該結(jié)果表明Ac53可能在感染的不同時(shí)期分別在核內(nèi)核外行使功能。 為了進(jìn)一步研究ac53在病毒侵染過程中的生物學(xué)功能，利用ET—同源重組技術(shù)將ac53從AcMNPV Bacmid中成功敲除，構(gòu)建出ac53缺失型重組病毒。同時(shí)，利用Bac—to—Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)把αc53基因補(bǔ)回至ac53缺失型重組病毒的多角體蛋白基因(polh)位點(diǎn)，構(gòu)建出ac53

7、補(bǔ)回型重組病毒。將轉(zhuǎn)座后均帶有綠色熒光蛋白基因(gfp)和polh雙標(biāo)記的三種重組病毒：野生型病毒、ac53缺失型重組病毒和ac53補(bǔ)回型重組病毒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ac53缺失型重組病毒不能產(chǎn)生有感染性的病毒粒子；而ac53補(bǔ)回型重組病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力與野生型基本一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ac53的缺失并沒有影響病毒DNA的復(fù)制。通過對(duì)病毒侵染細(xì)胞的超薄切片的透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)ac53補(bǔ)回型病毒的表型與野生

8、型病毒完全一致：而在ac53缺失型重組病毒感染的細(xì)胞中既有一些正常的核衣殼，又有大量類似核衣殼的空管子。以衣殼蛋白VP39的抗體為一抗進(jìn)行了免疫電鏡分析，證實(shí)了這些空管子是空的核衣殼，表明缺失ac53影響了核衣殼的裝配效率。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ac53是桿狀病毒生活周期的一個(gè)必需基因，在核衣殼的裝配過程中具有重要的作用。 利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Ac53的類鋅指環(huán)蛋白模序中的5個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)(Cys29，Cys32，His58，Cys6

9、1，Cys92)分別進(jìn)行了點(diǎn)突變，并將點(diǎn)突變的ac53與gfp融合，置于在ac53的啟動(dòng)子下，構(gòu)建了6株重組病毒：vAcac53(M58)GFP、Acac53(M61)GFP、Acac53(M92)GFP、vAcac53(M2932)GFP、vAcac53(M293261)GFP和vAcac53(M293292)GFP。將這6種重組病毒感染細(xì)胞后，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)：只有Ac53(M92)GFP融合蛋白的定位情況與野生型Ac53GFP一

10、致；其余5種融合蛋白在感染后的所有時(shí)相中都沒有入核，由始至終都定位于細(xì)胞質(zhì)的核外膜區(qū)域。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ac53的鋅指環(huán)蛋白模序?qū)τ贏c53的入核是必需的。 把以上6種點(diǎn)突變的ac53基因補(bǔ)回至ac53缺失型重組病毒的polh位點(diǎn)，構(gòu)建出6株點(diǎn)突變補(bǔ)回型重組病毒：vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP、Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M29

11、32REP—PH—GFP、vAcac53KO—M293261REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP。熒光顯微鏡觀察結(jié)果、光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果和病毒空斑實(shí)驗(yàn)表明，Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M2932REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP能形成可感染性病毒粒子，而其余3種點(diǎn)突變補(bǔ)回型重組病毒并不能進(jìn)行病毒的增殖。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明

12、Ac53的鋅指環(huán)蛋白模序?qū)τ诓《玖Ｗ拥脑鲋呈潜匦璧摹?將以上6株點(diǎn)突變補(bǔ)回型重組病毒侵染細(xì)胞后制備超薄切片進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)只有Acac53KO—M92REP—PH—GFP的電鏡觀察結(jié)果與野生型病毒一致，而其余5種點(diǎn)突變補(bǔ)回型重組病毒在它們侵染的細(xì)胞中都可以產(chǎn)生正常的核衣殼和大量類似核衣殼的空管子；并且在重組病毒vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP和vAcac53KO—