桿狀病毒chaB基因的研究.pdf

1、ChaB是假定的大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)ChaA的調(diào)節(jié)子，其存在于細菌、古細菌及桿狀病毒(Baculovirus)中的同源物構(gòu)成了一個多基因家族。目前chaB基因在桿狀病毒中的功能未知。本文選取甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhedrovirus，SeMNPV)基因組中的兩個EcolichaB同源基因即：開放閱讀框100和101(openre

2、adingframe100and101，ORF100andORF101)(分別命名為Se100和Se101基因)和苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)基因組中的兩個chaB基因即：ORF59和ORF60(分別命名為Ac59和Ac60基因)為研究對象，對這些基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯特征、蛋白在病毒結(jié)構(gòu)中的定位、核酸結(jié)合能力等進行了系統(tǒng)研究

3、，并就基因缺失對病毒侵染的影響等進行了初步研究。 Se100基因位于基因組的99254-99523nt之間，該閱讀框長270bp，編碼90個氨基酸，預(yù)期分子量為10.325kDa；Se101基因位于基因組的99537-100124nt之間，閱讀框長588bp，編碼196個氨基酸，預(yù)期分子量為23.027kDa；Ac59基因位于基因組的47882-48091nt之間，閱讀框長210bp，編碼70個氨基酸，預(yù)期分子量為8.173kD

4、a；Ac60基因位于基因組的48103-48366nt之間，閱讀框長264bp，編碼88個氨基酸，預(yù)期分子量為10.147kDa。序列分析表明，這些基因編碼的蛋白保守的N-端都含有一個約為60個氨基酸組成的、疏水的ChaB結(jié)構(gòu)域。據(jù)此，我們稱這些蛋白為桿狀病毒ChaB蛋白。 基于ChaB完整結(jié)構(gòu)域的進化分析表明，用于建立系統(tǒng)樹的43種ChaB蛋白可以分成四個不同的組，分別是：細菌組，顆粒體病毒(granulosisvirus，G

5、Vs)組，組Ⅰ(groupⅠ)核多角體病毒(nuclearpolyhedrosisvirus，NPVs)和組Ⅱ(groupⅡ)NPVs。Se101、Ac59屬于groupⅠNPVs，Se100、Ac60屬于groupⅡNPVs。 RT-PCR分析結(jié)果表明，Se100和Se101基因在病毒感染細胞中的轉(zhuǎn)錄均從24h開始可以檢測到，一直持續(xù)到感染后96h；而Ac59和Ac60基因在病毒感染細胞中的轉(zhuǎn)錄則從12h開始就可以檢測到，一直

6、持續(xù)到感染后72h。5'RACE分析發(fā)現(xiàn)，Se100和Se101基因轉(zhuǎn)錄分別起始于ATG上游9nt和12nt的桿狀病毒晚期啟動子ATAAG中的第一個嘌呤堿基A，與計算機預(yù)測的晚期啟動子位置一致；Ac59基因轉(zhuǎn)錄起始于ATG上游238nt的桿狀病毒晚期啟動子ATAAG中的第一個嘌呤堿基A，與計算機預(yù)測的晚期啟動子位置一致；而Ac60基因的轉(zhuǎn)錄則起始于ATG上游27nt的CAAAG中的堿基A。 參照SeMNPV全基因組序列中Se10

7、0和Se101基因全長序列設(shè)計2對引物，進行PCR擴增，將得到的這兩個基因克隆至pQE30表達載體上，在原核細胞中實現(xiàn)了基因的融合表達。同樣用PCR方法將Ac59和Ac60兩個基因分別克隆到原核表達載體pET32a(+)和pET28a(+)上也實現(xiàn)了兩個基因的融合表達。將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了四種蛋白的多克隆抗體。以獲得的抗體對感染SeMNPV不同時間的Se301細胞進行Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)在感染后48-96h的

8、細胞中均有一條大小為11kDa的特異蛋白帶能與Se100抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，這一大小與理論分子量相符，該蛋白從48h開始可以檢測到，是一個晚期表達的蛋白；Se101蛋白也是從感染后48h可以檢測到并持續(xù)到96hp.i.，表明該蛋白也是一個晚期表達的蛋白，但是檢測到的約28kDa的特異蛋白條帶比預(yù)期的(23.03kDa)偏大，推測可能是發(fā)生了某種翻譯后的修飾。以獲得的抗體對感染AcMNPV不同時間的Sf9細胞進行Westernblot分析

9、表明，對于Ac59抗體分別有一條約為38kDa和一條約為25kDa的蛋白帶能與其反應(yīng)，其中38kDa帶從12h就可以檢測到，并一直持續(xù)到72h，而25kDa的蛋白帶則從24h才可以檢測到并一直持續(xù)到72h，兩條雜交帶均遠遠大于推測的蛋白分子量(8.17kDa)；對于Ac60抗體分別有一條約為33kDa和一條約為17kDa的蛋白帶能與其反應(yīng)，其中33kDa帶從12h就可以檢測到，并一直持續(xù)到72h，而17kDa的蛋白帶則從24h才可以檢測

10、到并一直持續(xù)到72h，同樣兩條陽性反應(yīng)蛋白帶也比預(yù)期的理論分子量(10.147kDa)大，推測可能是由這些蛋白本身所固有的特性所致，或者發(fā)生了某些翻譯后修飾，更或者是形成了二聚體或多聚體。 通過Westernblot和雙色間接免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，在病毒感染的晚期，Se100、Se101蛋白和Ac59、Ac60蛋白均存在于細胞核和細胞質(zhì)中。四種蛋白均定位于包涵體來源型病毒粒子(occlusion-derivedvirus，ODV)的

11、核衣殼上，是ODV-特異的核衣殼蛋白。對分別感染SeMNPV和AcMNPV的細胞進行核組分的分離抽提發(fā)現(xiàn)，Se100和Se101蛋白主要是作為可溶性蛋白及與基因組DNA具有中等結(jié)合活性的核蛋白存在，也有可能與細胞的核結(jié)構(gòu)有關(guān)；Ac59和Ac60蛋白可能與細胞的核結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。柱層析結(jié)果表明，SeMNPVChaB能夠較弱地與DNA結(jié)合，AcMNPVChaB也能夠與DNA結(jié)合，四種蛋白對ssDNA的結(jié)合能力比對dsDNA的結(jié)合能力稍強。

12、 在AcMNPV基因組中同時存在著兩個方向相同的chaB基因，即orf59和orf60基因。本文采用ET-克隆技術(shù)在大腸桿菌DH10Bac-pBAD細胞中成功實現(xiàn)了從AcMNPVBacmid基因組敲除靶基因Ac59、Ac60和Ac59-60，并同時在靶位點插入氯霉素基因Cm。為了更直接的觀察chaB基因可能對病毒侵染產(chǎn)生的影響，將gfp基因和多角體基因作為雙標(biāo)記基因，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座作用插入AcΔ59/60/59-

13、60，構(gòu)建基因缺失型重組BacmidAcΔ59/60/59-60-PG。置于早期啟動子ie-l下表達的GFP熒光蛋白用以指示重組病毒芽生型病毒粒子(buddedvirus，BV)在離體細胞中的傳播，多角體蛋白則用來指示重組病毒在離體細胞中感染的進程。顯微觀察顯示，缺失型的重組病毒轉(zhuǎn)染的Sf9細胞中綠色熒光的擴散滯后于野生型病毒轉(zhuǎn)染的細胞，多角體變化的趨勢與綠色熒光的變化趨勢相似。靶基因chaB敲除后的重組病毒仍然具有感染性，但感染性病毒