家蠶核型角體病毒(BmNPV)Bn5的基因分析及利用基因芯片篩選抗BmNPV相關(guān)基因.pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovims，BmNPV)的天然宿主。家蠶核型多角體病毒是引起家蠶病毒嚴(yán)重感染的關(guān)鍵病原之一，病毒與宿主的相互博弈一直是研究者們關(guān)注的問題。家蠶抗NPV機(jī)制至今尚未完全明確，但究其病因可歸因于宿主與致病病毒兩方面因素。
　　 本研究以BmNPV核心基因Bm5為研究對象，從基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、亞細(xì)胞定位、病毒結(jié)構(gòu)定位和基因缺失等方面，研究基因

2、的基本特性及其功能。同時使用家蠶高密度Oligo表達(dá)譜芯片所提供了相關(guān)基因的基因組學(xué)的證據(jù)，突破了以往單個基因孤立研究的局限，在全基因組范圍內(nèi)篩選家蠶抗NPV相關(guān)基因，對篩選出基因進(jìn)行GO和Pathway分析，并進(jìn)一步用半定量PCR和熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，探討家蠶抗NPV的途徑和機(jī)理。論文主要結(jié)論如下：
　　 1.BmNPV的orf5(Bm5)位于基因組4，605--5，600nt，全長993bp，編碼一個含331個氨基酸殘基

3、的蛋白，預(yù)測分子量約為39.3kDa，Bm5是AcMNPVorfl3的同源序列。在Bm5基因ATG上游存在桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序ATAAG，在終止密碼子TAA下游發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號AATAAA，暗示了該基因是晚期表達(dá)基因。根據(jù)Bm5基因序列設(shè)計引物，分別以BmNPV基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的基因克隆至原核表達(dá)載體pET30a(+)，在原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的融合表達(dá)。純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了BM5蛋白的多克隆抗體。<

4、br>　　 2.RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，Bm5在病毒感染宿主細(xì)胞12h開始轉(zhuǎn)錄，直到72h。利用抗體進(jìn)行Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)Bm5的表達(dá)產(chǎn)物在病毒感染宿主細(xì)胞后24h被檢測出來，一直持續(xù)72h都有表達(dá)，大小為39.3kDa，與預(yù)測的大小一致，說明Bm5是一個晚期表達(dá)基因，而且沒有轉(zhuǎn)錄后修飾。Westernblot方法檢測分離出的BV、ODV粒子，表明BM5不是病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白。利用抗體檢測發(fā)現(xiàn)BM5定位在細(xì)胞質(zhì)中。

5、　　 3.利用Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌中成功地對BmNPV的Bm5基因進(jìn)行了快速定點(diǎn)敲除。并將BmNPV/Bac-to-Bac系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)結(jié)合在一起，對敲除了Bm5基因的BmNPV進(jìn)行了拯救。分別構(gòu)建了野生型病毒vBm5-Wt、Bm5基因缺失病毒vBm5-Ko和Bm5基因拯救病毒vBm5-Re。
　　 4.應(yīng)用基因芯片技術(shù)在家蠶抗NPV品系BC8、感性品系306中篩查抗性相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)93個差異表達(dá)基因其中表達(dá)上調(diào)

6、基因44個，下調(diào)基因49個。GO分析表明93個基因中51個其中24個上調(diào)基因、27個下調(diào)基因具有功能注釋。GO分析結(jié)果顯示分子功能方面主要有酶活性、氧化還原活性、酶綁定、結(jié)構(gòu)成分、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等；生物進(jìn)程方面主要有新陳代謝、蛋白質(zhì)水解、電子轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)定位、轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)生物等功能；細(xì)胞組分方面主要有細(xì)胞內(nèi)、膜核糖體、胞外區(qū)等。Pathway分析表明有新陳代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酸代謝、核糖體、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、糖酵解/糖異和檸檬酸

7、循環(huán)(TCA循環(huán))等通路。
　　 5.為了驗(yàn)證芯片篩選出差異表達(dá)基因，從93個差異基因挑選14個表達(dá)量差異大基因（9個上調(diào)基因、5個下調(diào)基因）進(jìn)行RT-PCR，依據(jù)結(jié)果再從14個基因中挑選10個差異基因（7個上調(diào)基因、3個下調(diào)基因）進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果表明了7個上調(diào)基因中5個基因在NB、BC8各時間點(diǎn)的表達(dá)量高于306，鑒定為抗性相關(guān)上調(diào)基因，2個基因在BC8表達(dá)量高于NB、306。3個下調(diào)基因在306的表達(dá)量要高于NB、B