利用基因芯片技術(shù)篩選敵敵畏中毒腦損傷的相關(guān)基因.pdf

1、目的：從急性敵敵畏中毒導(dǎo)致腦損傷的模型大鼠和正常大鼠的海馬組織中提取總RNA，與構(gòu)建的敵敵畏中毒腦損傷相關(guān)基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，找出差異表達(dá)基因，從分子水平探討有機(jī)磷中毒致腦損傷的機(jī)制，為臨床救治提供線索。 方法：實(shí)驗(yàn)采用以核酸雜交為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)尋找差異表達(dá)基因。從中外文獻(xiàn)中查找大鼠海馬中與抽搐、神經(jīng)毒素中毒有關(guān)的基因，在基因庫(kù)(Genebank)中找出其mRNA序列，用探針設(shè)計(jì)軟件處理這些基因序列，比對(duì)核苷酸序列(Nu

2、cleotideblast)從中找出符合基因芯片探針條件的mRNA片段作為寡核苷酸探針。用合成儀合成探針，并與點(diǎn)樣液等比例混勻后用點(diǎn)樣儀將探針按一定順序點(diǎn)在醛基修飾的玻璃片上制成寡核苷酸芯片。每次取體重160-200g的Wistar大鼠4只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠按照13mg/kg的劑量皮下注射敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照組皮下注射相同體積的生理鹽水。中毒大鼠發(fā)生強(qiáng)直痙攣性抽搐20分鐘后斷頭活殺，對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活

3、殺，分別取海馬組織，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄并熒光標(biāo)記后與構(gòu)建的芯片進(jìn)行雜交。雜交后的芯片經(jīng)過(guò)洗滌、晾干后用掃描儀進(jìn)行掃描，對(duì)獲取的圖像信息進(jìn)行分析，尋找出表達(dá)水平發(fā)生了變化的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行分析。從差異表達(dá)基因中挑選兩條進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察所選基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)有無(wú)差異，表達(dá)變化的情況和基因芯片的結(jié)果是否一致，從而對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠都能在給藥后3

4、-5分鐘發(fā)生強(qiáng)直痙攣性抽搐，并能持續(xù)存活20分鐘以上，成功的建立了急性敵敵畏中毒大鼠模型。電泳結(jié)果和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果表明，從大鼠海馬中抽提的總RNA，無(wú)論實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，其完整性和純度都是符合實(shí)驗(yàn)要求的。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，找出了40條表達(dá)可能發(fā)生變化的基因探針，將2條水稻基因探針作為陰性對(duì)照，和5條大鼠看家基因探針共同構(gòu)成包含50條探針的基因芯片。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并用雙色熒光標(biāo)記后與芯片雜交，找出了8條差異表達(dá)基因，分別

5、是：MT-1、Ho-1、AceRM5、GABAR-B3、SOD、MaoA、Scg-10、Chrna-7。這些基因的表達(dá)都發(fā)生了上調(diào)，這與文獻(xiàn)的報(bào)道是一致的。RT-PCR的結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組海馬組織內(nèi)SOD、HO-1的表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與基因芯片的檢測(cè)結(jié)果是一致的。 結(jié)論：基因芯片技術(shù)能夠快速、有效、大規(guī)模篩選差異表達(dá)的基因，有傳統(tǒng)的研究差異表達(dá)基因的方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)：高通量同步分析、全自動(dòng)快速分

6、析、高靈敏度精確分析。同時(shí)，芯片上的每一個(gè)探針都嚴(yán)格依照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與相應(yīng)基因進(jìn)行雜交，只有一個(gè)差異堿基的基因也會(huì)表現(xiàn)出雜交信號(hào)的不同。因此，我們選擇該方法對(duì)有機(jī)磷化合物中毒導(dǎo)致驚厥的大鼠和正常對(duì)照大鼠的海馬組織之間差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和比較。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在敵敵畏中毒誘發(fā)驚厥的大鼠海馬中發(fā)生了基因調(diào)控表達(dá)的變化。對(duì)這些表達(dá)發(fā)生變化的基因功能進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，提示這些基因與膽堿能系統(tǒng)、煙堿能系統(tǒng)的過(guò)度興奮、腦組織缺血缺氧、氧自由基超負(fù)荷、抑