家蠶BmNPV抗性基因的篩選與定位.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式昆蟲，也是重要的經(jīng)濟昆蟲。在中國和印度等發(fā)展中國家，蠶絲具有很高的經(jīng)濟價值，是很多地區(qū)農(nóng)民的主要收入來源。但是，家蠶病害的發(fā)生也給桑蠶業(yè)帶來了極大困擾。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年因家蠶病害造成的損失約為總產(chǎn)量的三成，嚴重制約了蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最大的疾病，其中家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）引起的血液型膿病危害最大，約占蠶病損失

2、的70％，該蠶病目前還停留在預防階段。因此從生產(chǎn)和安全方面來講，家蠶核型多角體病毒抗性基因的尋找和抗性品種的組配都是一項重要工作。
　　本課題采用耐BmNPV蠶品種華康2號一代雜交種同蛾區(qū)交配形成的近交系抗性品系AN、抗BmNPV蠶品種野三元N中的抗性親本野BN、BmNPV中等抗性蠶品種大造（p50）和易感性品系 C108作為研究材料，首先對不同家蠶品種對BmNPV抵抗力大小進行研究。在此基礎上，構(gòu)建抗性主基因連鎖分析群體和定位群

3、體，通過遺傳育種技術、SSR分子標記技術、HRM分析技術對抗性主基因進行精細定位；用抗性品系AN、p50與C108構(gòu)建基因分離群體，利用SSR分子標記技術、HRM分析技術對BmNPV抗性微效基因進行初步連鎖分析。主要實驗內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、家蠶AN品系BmNPV抗性主基因的精細定位
　　本研究根據(jù)抗性主基因的遺傳規(guī)律以及家蠶對BmNPV的耐受性，選擇抗性品系AN作為母本（P1），感性品系C108作為父本（P2）及回交本

4、，二者雜交組配F1群體；F1代雌性個體回交C108雄性個體組配BC1F，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食 BmNPV病毒多角體濃度為1×108/mL浸漬的桑葉，收集存活個體作為BC1F連鎖分析群體；F1代雄性個體回交 C108雌性個體組配 BC1M，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食BmNPV病毒多角體濃度為1×108/mL浸漬的桑葉，收集存活個體作為 BC1M定位分析群體。以此類推，組配BC2F和BC2M群體。用P1、P2和F1為模板，篩選與抗性主基因連鎖

5、的多態(tài)性標記；用BC1F和BC2F群體對抗性主基因進行連鎖分析，確定其連鎖群；用 BC1M和 BC2M群體對其進行定位分析。
　　AN品系對BmNPV抗性鑒定結(jié)果表明，在2齡起蠶經(jīng)口添食BmNPV病毒多角體時，半數(shù)致死濃度（LC50）為2.154×109個/mL，半數(shù)致死劑量（LD50）為1.436×107個/頭蠶。
　　綜合F1、BC1、BC2的經(jīng)口接種BmNPV病毒多角體的半數(shù)致死濃度（LC50）結(jié)果可以認為，AN品系對

6、BmNPV具有高度抗性，該性狀受1個位于常染色體的顯性主基因控制，性染色體對AN品系BmNPV高抗性沒有影響。
　　通過SSR分子標記HRM分析技術進行連鎖分析表明，家蠶AN品系BmNPV抗性主基因位于家蠶第27連鎖群。通過BC2M定位群體600余個體的基因組定位分析，繪制了遺傳總距離為29.1cM的AN品系BmNPV抗性主基因遺傳連鎖圖，SSR標記 s2800-9（nscaf2800:1311765~1311847）和 SSR標

7、記 s2801-35(nscaf2800:117840~118038)位于該基因兩側(cè)，抗性主基因與2個標記的遺傳距離分別為5.2cM和2.9cM，由于兩個標記間家蠶基因組序列存在一個gap，因此暫時無法實現(xiàn)進一步的精細定位。
　　2、家蠶野BN品系BmNPV抗性主基因的定位分析
　　以BmNPV抗性品種野BN作為父本（P1），感性品系C108作為母本（P2）及回交親本，二者雜交組配F1群體；F1代雌性個體回交C108雄性個體

8、構(gòu)建BC1F群體，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬的桑葉，收集存活個體作為 BC1F連鎖分析群體；F1代雄性個體回交C108雌性個體構(gòu)建BC1M群體，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬的桑葉，收集存活個體作為 BC1M基因組定位群體。以此類推，組配BC2F和BC2M群體。
　　野BN對BmNPV抗性鑒定結(jié)果表明，在2齡起蠶經(jīng)口添食BmNPV病毒多角體

9、時，野BN的半數(shù)致死濃度（LC50）為2.083×109個/mL，野BN的半數(shù)致死劑量（LD50）為2.5×107個/頭蠶。
　　BC1F群體連鎖分析結(jié)果表明，野BN品種在第27連鎖群上存在著1個抗性主基因、其他連鎖群上可能還存在抗性主基因。
　　通過對4個蛾區(qū)BC2M定位分析群體、第27連鎖群6個多態(tài)性標記的HRM分析結(jié)果表明，野BN品種除了在第27連鎖群上存在著1個BmNPV抗性主基因外，在27連鎖群以外確實存在著1個能

10、夠耐受1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬桑葉經(jīng)口添毒的抗性主基因。
　　3、抗性微效基因的連鎖分析
　　（1）抗性品系AN
　　家蠶抗性品系AN對BmNPV的抗性基因，除抗性主基因外還存在較多的抗性微效基因。選擇抗性品系AN作為母本（P1），易感性品系C108作為父本（P2）和回交親本，得到BC2F群體，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×107/mL的核型多角體病毒懸液浸漬桑葉，收集存活個體再對其進行第27連鎖

11、群分子標記基因型鑒定，選擇其中無AN品系來源第27連鎖群（染色體）即無抗性主基因存在的蛾區(qū)，組配BC3F、BC4F群體作為構(gòu)建抗性微效基因的連鎖分析群體。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，第6連鎖群上存在抗性微效基因。
　　（2）抗性品系p50
　　選擇抗性品系p50作為母本（P1），易感性品系C108作為父本（P2）及回交本，二者雜交組配 F1群體；F1代雌性個體回交 C108雄性個體，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×107/mL的BmNP