BmNPV侵染后家蠶組織形態(tài)學(xué)觀察和相關(guān)基因篩選.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）病是對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)危害最為嚴(yán)重的一類(lèi)傳染性疾病，每年由此病給蠶繭造成的損失，大約占蠶病損失的70％左右。但是到目前為止，家蠶抗BmNPV病作用機(jī)制仍不明晰。本研究利用本課題組育成的對(duì)BmNPV高度抗性的品種為素材，對(duì)其經(jīng)BmNPV侵染后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)和組織切片觀察，并利用RNA-seq技術(shù)對(duì)抗性素材和常規(guī)品種的脂肪體組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，獲得可能涉及抗性機(jī)制的差異基因，同時(shí)，篩選出一段長(zhǎng)1512bp的cDNA序

2、列，屬于家蠶海藻糖輔酶基因家族。熒光定量PCR檢測(cè)該基因在抗性品種秋豐N脂肪體和中腸組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)，初步推測(cè)家蠶海藻糖輔酶與家蠶對(duì)BmNPV的抗性存在一定關(guān)聯(lián)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1、家蠶組織形態(tài)學(xué)觀察和組織切片觀察
　　為探究BmNPV侵染家蠶后其組織在形態(tài)學(xué)上的變化，選用抗性品種秋豐N和常規(guī)品種秋豐兩個(gè)家蠶品種進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示：家蠶經(jīng)口添 BmNPV60h后常規(guī)品種秋豐血液與抗性品種秋豐N相比，

3、開(kāi)始出現(xiàn)渾濁狀，說(shuō)明病毒增殖顯著。中腸組織在添食60h左右與對(duì)照組比起來(lái)顏色略深，在84h之后出現(xiàn)糜爛、萎縮的狀態(tài)。經(jīng)皮下穿刺BmNPV48h左右家蠶血液與對(duì)照組比開(kāi)始出現(xiàn)渾濁狀，在60h渾濁比較明顯說(shuō)明病毒增殖接近平臺(tái)期，中腸組織在72h左右與對(duì)照組比較開(kāi)始出現(xiàn)泛黃、糜爛，在96h之后萎縮發(fā)黑，而抗性品種秋豐N，各相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均未觀察到明顯的病變，無(wú)論中腸、血液，形態(tài)觀察良好，沒(méi)有出現(xiàn)BmNPV侵染后在常規(guī)素材中的性狀。推測(cè)抗性品種中

4、存在的某種抗性或清除機(jī)制導(dǎo)致了抗性品種對(duì)BmNPV的高度抵抗性。
　　2、BmNPV侵染家蠶抗性和非抗性品種后脂肪體組織的轉(zhuǎn)錄組分析
　　利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)秋豐和秋豐N轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從2個(gè)獲得的文庫(kù)中獲得14.78Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)（在秋豐和秋豐 N中分別超7.15Gb）。與參考基因組（www.silkdb.org）比對(duì)，在家蠶秋豐品種中共檢測(cè)到78408個(gè)SNPs，在秋豐N品種中檢測(cè)到56786個(gè)SNPs。同時(shí)，在

5、2個(gè)品種中均發(fā)現(xiàn)特異RNA選擇性剪接事件。BmNPV侵染48h后，秋豐N與秋豐品種比起來(lái)脂肪體有1728個(gè)差異表達(dá)基因（242個(gè)表達(dá)上調(diào)和1540個(gè)表達(dá)下調(diào)）。GO分類(lèi)分析表明這些差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞膜、新陳代謝、細(xì)胞結(jié)合和催化活性、細(xì)胞組分等過(guò)程相關(guān)。KEGG注釋通路分析表明，在氧化磷酸化、吞噬體、三羧酸循環(huán)、精氨酸、脯氨酸代謝丙酮酸代謝過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)較高水平的基因表達(dá)。同時(shí)，COG分析表明差異表達(dá)基因涉及到“氨基酸運(yùn)輸和代謝”和“信

6、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”。
　　在一些功能分類(lèi)中我們鑒定出了大量的差異表達(dá)基因，這表明家蠶在被感染后出現(xiàn)一系列主要的病理變化和一些與抗病機(jī)制有關(guān)的功能。氧化應(yīng)激可能與家蠶抗BmNPV感染相關(guān)。另外，諸如氧化磷酸化等許多代謝活動(dòng)都對(duì)家蠶抗性機(jī)制起到作用。此外，需要了解這些單一通路差異表達(dá)基因的生理功能對(duì)進(jìn)一步研究其特性以及確定其在免疫過(guò)程中所起的作用。這些發(fā)現(xiàn)提供了新的研究方向，將在分子水平加深我們對(duì)病毒抗性機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　3、家蠶抗B

7、mNPV抗性基因的篩選
　　用抗性品種秋豐N和常規(guī)品種秋豐的中腸和脂肪體組織，克隆了一條長(zhǎng)為1512bp的cDNA序列，比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)其屬于家蠶海藻糖輔酶基因家族的tret基因，該基因共編碼504個(gè)氨基酸。該基因編碼的蛋白質(zhì)質(zhì)量為120.456KD,等電點(diǎn)為7.89。熒光定量PCR檢測(cè)該基因在抗性家蠶幼蟲(chóng)的脂肪體、中腸、血液中均有表達(dá)。在幼蟲(chóng)的各個(gè)組織中，以中腸和血液中的表達(dá)量最高，脂肪體次之。研究結(jié)果顯示，家蠶幼蟲(chóng)被BmNPV感染