精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常的形態(tài)學(xué)研究和致病基因鑒定.pdf

1、目的：
　　觀察精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（multiple morphological abnormalitiesof the sperm flagella，MMAF）患者精子光鏡和電鏡下的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，分析鞭毛畸形與精子活動(dòng)率的關(guān)系。觀察MMAF患者行卵胞漿內(nèi)單精子注射治療的臨床結(jié)局。鑒定中國MMAF患者的致病基因。
　　方法：
　　1、對(duì)表現(xiàn)為弱精子癥或完全性不活動(dòng)精子的患者，通過光鏡下形態(tài)觀察初步診斷MMAF，并對(duì)鞭毛

2、形態(tài)細(xì)化分類。通過掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)一步觀察病變精子超微結(jié)構(gòu)，明確纖維鞘、線粒體鞘、外周致密纖維及軸絲畸形，計(jì)算中心微管缺失率。分析射精中有無活動(dòng)精子與鞭毛形態(tài)之間的關(guān)系。
　　2、對(duì)7例中國MMAF患者采取卵胞漿內(nèi)單精子注射輔助生育。卵胞漿內(nèi)單精子注射首選精液中活動(dòng)精子。如射精中不能找到活動(dòng)精子則采取低滲腫脹試驗(yàn)選取活精子;或采用睪丸精子;或卵子凍存后待下次從射精中尋找活動(dòng)精子。觀察受精率、胚胎質(zhì)量并隨訪妊娠結(jié)局。
　　

3、3、先后采取了Sanger測(cè)序和全外顯子組測(cè)序的方法篩選MMAF患者的可能致病基因。首先，通過Sanger法對(duì)3例患者AKAP3、AKAP4、MNS1和SPEF2基因外顯子測(cè)序，對(duì)6例患者DNAH1基因可能的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)測(cè)序。因未明確致病突變，進(jìn)而通過HiSeq X-Ten(Illumina)平臺(tái)，對(duì)19例MMAF患者采取全外顯子組測(cè)序，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1、通過光鏡下形態(tài)分析診斷MMAF患者

4、28例，其中15例(53.6％)患者未檢測(cè)到活動(dòng)精子。13例(46.4％)患者可檢測(cè)到活動(dòng)精子，其中12例患者精子活動(dòng)率＜10％。精子存活率9.0-80.0％。光鏡和掃描電鏡下可見MMAF精子鞭毛缺失、短、卷曲、彎折和不規(guī)則寬度等多種畸形及其組合，MMAF缺陷精子占94.0±5.9％。透射電鏡表現(xiàn)為精子鞭毛纖維鞘、線粒體鞘等多種結(jié)構(gòu)組裝異常，中心微管缺失率41.4-84.6％。動(dòng)力蛋白臂缺失或存在，內(nèi)、外側(cè)動(dòng)力蛋白臂均缺失的2例患者精液

5、中無活動(dòng)精子。射精中無活動(dòng)精子和存在活動(dòng)精子的兩組患者間，各種鞭毛畸形構(gòu)成比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、卵胞漿內(nèi)單精子注射治療的7例患者，均表現(xiàn)為嚴(yán)重弱精子癥，精子活動(dòng)率0-8.5％。輔助生殖采用的精子，3例為射精中活動(dòng)精子，1例為通過低滲腫脹試驗(yàn)挑選的活精子，2例為睪丸精子，1例因無活動(dòng)精子凍卵待用。本組MMAF患者ICSI受精率為50.0％(44/88)，妊娠率26.7％(4/15)，其中2例自然流產(chǎn)，2例分別分娩1男嬰和

6、1女嬰。
　　3、通過Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)AKAP3、MNS1和SPEF2基因的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)致病突變。DNAH1基因的熱點(diǎn)位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)致病突變。通過全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，11例患者攜帶DNAH1基因突變純合或復(fù)合雜合突變，占57.9％(11/19);在1例患者中發(fā)現(xiàn)CCDC39純合突變。經(jīng)生物信息學(xué)分析和Sanger測(cè)序驗(yàn)證確認(rèn)DNAH1和CCDC39為MMAF的致病基因。
　　結(jié)論:
　　1、MMAF是

7、嚴(yán)重弱精子癥和完全性不活動(dòng)精子的原因之一，光鏡下表現(xiàn)為鞭毛缺失、短、卷曲、彎折和不規(guī)則寬度等多種畸形。透射電鏡可見以中心微管缺失為主要特征的整個(gè)鞭毛組裝異常。內(nèi)、外側(cè)動(dòng)力蛋白臂均缺失可導(dǎo)致完全性不活動(dòng)精子。
　　2、MMAF患者精子鞭毛嚴(yán)重畸形，卵胞漿內(nèi)單精子注射是一種有效的輔助生育手段。本組MMAF患者ICSI受精率和妊娠率低于其他因素的ICSI患者，最終結(jié)論有待大樣本觀察。
　　3、全外顯子組測(cè)序是鑒定MMAF致病基因的