野生稻抗性候選基因的篩選和克隆.pdf

1、本研究采用了茶陵野生稻、東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻等3個野生稻品種與部分可轉化大片段藥用野生稻基因組文庫等材料進行了野生稻抗性候選基因的轉化與克隆研究。研究主要結果如下： 1.東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻、茶陵野生稻等3個不同野生稻品種的總DNA電泳結果表明，采用CTAB法提取野生稻總DNA可行，并且提取的DNA質量能夠滿足野生稻基因轉化與克隆及其他分子生物學分析要求；3個不同野生稻品種的總DNA分子量相差不大，DNA片段長度均在23KB

2、左右； 2.選用9對引物分別對東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻與茶陵野生稻等3個不同野生稻的總DNA進行了引物擴增篩選，結果表明第6對(代號為WR-1、WF-1)和第10對(代號為S2、AS3)引物的擴增效果最好，主要表現(xiàn)為帶型最清楚，非特異性擴增也最少。因此，用第6對引物對茶陵野生稻總DNA進行擴增、回收、克隆及測序分析，初步得到4類不同的抗性候選基因材料；用第10對引物對東鄉(xiāng)野生稻總DNA進行擴增、回收、克隆，得到34個陽性重組子；

3、 3.在用WF-1、WR-1引物對茶陵野生稻總DNA進行PCR擴增的過程中，發(fā)現(xiàn)簡并引物的用量應該比普通特異性引物要高很多倍才能達到擴增的效果，通過1μL(12.5μmol)、2μL(25μmol)、4μL(50μmol)、8μL(100μmol)、16μL(200μmol)等5種不同簡并引物濃度的實驗，結果表明16μL(200μmol)的引物濃度的擴增效果最好，其電泳帶型最清楚，非特異性的擴增也最少，結果符合簡并引物合成原則即簡

4、并性要好且簡并性不能太高； 4.通過WF-1、WR-1引物對藥用野生稻的可轉化大片段基因組BIBAC2文庫編號為117的384孔板進行抗性候選基因的篩選，篩選出117M18，117M19，117M22，117N2，117N5等五個克隆，選出117M18與117N5進行回收、連接及測序分析，發(fā)現(xiàn)這兩個克隆序列的同源性高達99.8﹪，并且與從茶陵野生稻里得到的4類抗性候選基因中的CL17那一類的同源性也高達99.6﹪。通過在NCBI

5、網(wǎng)站里Blast搜索得知：它與粳稻第三號染色體上的DP000009.1(GI：73746173)存在高度的同源性； 5.同時通過實驗我們還得知許多根據(jù)抗性基因保守序列設計的引物都能擴增得出構建基因文庫所用的BIBAC2空載體； 6.對藥用野生稻可轉化大片段基因組文庫進行質粒轉化到農(nóng)桿菌LBA4404，得到164個攜帶藥用野生稻基因組片段的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，從中挑選了117K6，117K8，117K9，117K10