福建野生蕉離體繁殖及其抗性基因克隆與定量表達分析.pdf

1、芭蕉是江南園林的代表性植物，野生蕉作為新興的芭蕉類觀賞植物應(yīng)用日益受到重視。福建省分布有豐富的野生蕉資源，各地野生蕉在形態(tài)特征和生長發(fā)育習(xí)性上均有不同程度的差異。福建省是野生蕉分布的北緣區(qū)域，新近發(fā)現(xiàn)的大規(guī)模野生蕉資源分布，對于研究芭蕉屬植物的起源與進化有重要的價值。同時，野生蕉抗性強，特別是其抗寒性的特點，不僅本身可以直接應(yīng)用于容易受凍地區(qū)的園林綠化，而且可以從中挖掘抗寒等抗性基因資源，用于改良不耐寒的芭蕉屬觀賞植物，拓展觀賞芭蕉植物

2、的應(yīng)用范圍，使較寒冷的地區(qū)也可以種植展示南國風(fēng)光的標志性植物。但是，目前福建野生蕉資源的研究還很少，因此有必要采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段進行野生蕉的研究。本研究擬以福州宦溪野生蕉、三明野生蕉等福建野生蕉為材料，進行離體培養(yǎng)、基因克隆及其在低溫下的qPCR分析，為其開發(fā)利用提供技術(shù)支撐或科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　1、福建野生蕉資源的離體繁殖研究
　　根據(jù)Smmonds& Shepherd（1955）的評分方法，福州宦溪野生蕉屬于

3、AB類群，但比較接近AA類群，與福建其他地區(qū)的野生蕉（福州野生蕉的AA類群和三明野生蕉的AB類群）有一定的親緣關(guān)系，但又有明顯差別，增加了福建野生蕉資源的遺傳多樣性。
　　本研究首先以福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的吸芽為外植體，建立了離體繁殖的無菌體系。30d進行觀察統(tǒng)計，福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的不定芽誘導(dǎo)率達75%。
　　其次，利用本實驗室已繼代保存的三明野生蕉試管苗進行增殖條件的優(yōu)化。①比較不同光質(zhì)（紅光、藍光

4、、綠光、白光）、不同光強（0 Lx、500 Lx、1000 Lx、1500 Lx，白光）對三明野生蕉小苗增殖的影響，結(jié)果表明：在白光、1000Lx光照強度下，三明野生蕉試管苗的增殖效果最好。②在MS培養(yǎng)基上添加NAA（0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L）、6-BA（2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L）、Ad（0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L）不同組合的生長調(diào)節(jié)劑的3因素3水平正交試驗結(jié)果表明：對三明野生蕉

5、小苗增殖影響程度依次為 Ad＞6-BA＞NAA，在MS+NAA0.1 mg/L+6-BA4 mg/L+Ad30 mg/L培養(yǎng)基（處理5）中增殖效果最好。③在MS培養(yǎng)基上添加NAA（0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L）、6-BA（0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L）、Ad（15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L）不同組合生長調(diào)節(jié)劑的3因素3水平的正交試驗表明：生長調(diào)節(jié)劑對三明野生蕉小苗薄層切片增殖影響程度依次為

6、6-BA＞Ad＞NAA，三明野生蕉小苗薄層切片在MS+NAA0.2 mg/L+Ad30 mg/L培養(yǎng)基（處理4）中小苗不定芽增殖數(shù)最多，且苗高較高。④在MS培養(yǎng)基上添加NAA（0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L）、6-BA（2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L）、Ad（0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L）不同組合的生長調(diào)節(jié)劑的3因素3水平的正交試驗表明：生長調(diào)節(jié)劑對三明野生蕉類原球莖（多芽體）增殖影響程度依次

7、為Ad＞NAA＞6-BA，MS+6-BA6 mg/L+Ad30 mg/L（處理3）最適合三明野生蕉類原球莖（多芽體）的增殖；生長調(diào)節(jié)劑對三明野生蕉類原球莖（大芽）增殖影響程度依次為NAA＞6-BA＞Ad，MS+NAA0.2 mg/L+6-BA4 mg/L（處理8）最適合三明野生蕉類原球莖（大芽）的增殖。以三明野生蕉小苗增殖的優(yōu)化條件進行不同基因型野生蕉資源增殖比較的結(jié)果表明：三明野生蕉小苗的優(yōu)化增殖條件也適合福州宦溪野生蕉、福州北峰野生

8、蕉。
　　最后，以三明野生蕉、福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的試管苗為材料進行生根研究，結(jié)果表明：NAA0.4 mg/L對野生蕉試管苗的生根效果好，在泥炭土、園土、沙土（1:1:0.5）的混合基質(zhì)中成活率達到94%。
　　2、福建野生蕉抗寒等抗性基因的分離
　　以福州宦溪野生蕉（M. acuminata, AB group）葉片為材料提取總RNA，利用RT-PCR、RACE法，并參考馬來西亞小果野蕉（M. acumin

9、ata, AA group）全基因組測序數(shù)據(jù)庫，從福州宦溪野生蕉葉片中分離抗寒等抗性基因cDNA及DNA序列，共得到福州宦溪野生蕉抗寒關(guān)鍵基因CBF等基因cDNA及DNA全長序列20條，包括CDPK抗寒途徑中的主要抗寒基因 CBF(CBF7-1)、ICE1（ICE1-1、ICE1-2、ICE1-3、 ICE1-4、 ICE1-5、ICE1-6）、HOS1共8條cDNA全長序列,抗性脅迫“總分子開關(guān)”基因KIN10的6個成員（KIN10-

10、1、KIN10-2、KIN10-3、KIN10-4、KIN10-5、KIN10-6），抗性基因CHUP1、PSAG1、PSAG23條cDNA全長序列，以及抗性基因CHUP1、PSAG1、PSAG23條編碼區(qū)DNA序列（GenBank登錄號分別為：CBF7-1：KC157575；ICE1-1~6：KC157569、KC157570、KC157571、KC157572、KC157573、KC157574；HOS1：JX678611；KIN1

11、0-1~6：KC127685、KC127686、KC127687、KC127688、 KC127689、KC127690；PSAG1cDNA：JX317082、PSAG2 cDNA：JX317083；PSAG1DNA：JX678610、PSAG2 DNA：JX678609；CHUP1 cDNA：JX123753、CHUP1 DNA：JX880084）。
　　福州宦溪野生蕉CHUP1編碼區(qū)基因組序列含有8個內(nèi)含子、9個外顯子，馬來西

12、亞小果野蕉基因組測序公布的CHUP1編碼區(qū)基因組序列含有11個內(nèi)含子、12個外顯子，兩者相差較大。福州宦溪野生蕉PSAG1、PSAG2基因組不含有內(nèi)含子。
　　3、福建野生蕉抗性基因的生物信息學(xué)分析
　　生物信息學(xué)分析表明：①福州宦溪野生蕉CBF7-1蛋白屬于穩(wěn)定、親水蛋白；具有信號肽，由亞細胞定位推測福州宦溪野生蕉CBF7-1定位在細胞核中；共有8個磷酸化位點；CBF7-1具有CBF典型的AP2/ERF domain保守結(jié)

13、構(gòu)域。②福州宦溪野生蕉ICE16個成員均屬于不穩(wěn)定、親水蛋白；不具有信號肽，由亞細胞定位推測福州宦溪野生蕉ICE1s定位在細胞核中；ICE16個成員磷酸化位點總數(shù)不等，介于20-30之間；ICE1的6個成員均具有ICE1特有的Helix-loop-helix保守結(jié)構(gòu)域。③福州宦溪野生蕉HOS1屬于不穩(wěn)定、親水蛋白；不具有信號肽，由亞細胞定位推測福州宦溪野生蕉HOS1定位在細胞核中；共有57個磷酸化位點；具有ELYS-like特征保守結(jié)構(gòu)

14、域。④福州宦溪野生蕉KIN10屬于穩(wěn)定、親水蛋白；由亞細胞定位推測福州宦溪野生蕉KIN10s定位于細胞核或質(zhì)膜；KIN106個成員磷酸化位點總數(shù)不等，介于21-26之間；KIN106個成員有多達10-13個保守結(jié)構(gòu)域，很罕見，表明了其獨特的多樣性功能；同時，我們還發(fā)現(xiàn) KIN10的保守結(jié)構(gòu)域多數(shù)為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，是其發(fā)揮植物脅迫調(diào)控“總開關(guān)”的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。⑤福州宦溪野生蕉 CHUP1屬于不穩(wěn)定、親水蛋白；具有信號肽、為雙向跨膜螺旋；共

15、有62個磷酸化位點，有3個保守結(jié)構(gòu)域：Actin-binding FH2保守結(jié)構(gòu)域、SF0亞家族結(jié)構(gòu)域和SignalP-NN（euk）信號肽。Actin-binding FH2保守結(jié)構(gòu)域參與葉綠體移動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。⑥福州宦溪野生蕉 PSAG1、PSAG2屬于穩(wěn)定、親水蛋白；不具有信號肽、為跨膜蛋白，定位在微體或葉綠體；各有4個磷酸化位點；含有有一個光系統(tǒng)I的K亞基超家族保守結(jié)構(gòu)域。兩個PSAG成員的核苷酸序列及氨基酸序列都同源性高，且

16、蛋白的三級結(jié)構(gòu)也差異不大，這種基因的功能冗余進一步保證了PSAG功能上的穩(wěn)定性。
　　4、福建野生蕉抗寒基因的熒光定量表達分析
　　低溫能夠誘導(dǎo)植物許多基因的表達，從而使植物具有抗寒性。對福州宦溪野生蕉組培苗進行0℃、4℃、13℃、20℃、28℃溫度處理，采用SYBR Green熒光定量PCR方法，檢測宦溪野生蕉抗寒相關(guān)基因 CBF7-1、ICE1s（ICE1-1~ICE1-4）、HOS1、KIN10s在低溫脅迫處理下的相對

17、表達量，以驗證宦溪野生蕉中這些抗寒性基因的功能。研究結(jié)果表明：在13℃， KIN10s、ICE1s的表達量顯著上調(diào)，均達到最高值，表明在普通香蕉停止生長的13℃，野生蕉體內(nèi)抗寒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中上游基因KIN10s和ICE1s因得到了大量的表達，以提高植株的抗寒性。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，HOS1雖然在13℃比20℃有微量升高，但在繼續(xù)降溫時，表達量劇激下降。在0℃時，HOS1表達量降到最低值，這時候ICE1表達量明顯回升。HOS1對ICE1有負

18、調(diào)控作用，HOS1的下降有助于提高ICE1的水平，從而植物植物的抗寒性。這是它們之間表達模式上的差異，也符合CBF抗寒途徑相關(guān)基因的表達特征。本研究中，宦溪野生蕉的CBF7-1的表達模式與KIN10s、ICE1s、HOS1不同，總體上隨著溫度的降低而表達量下降，但在0℃時反而又升高。綜上所述，福州宦溪野生蕉 CBF途徑抗寒基因表達的可能分子機制為：當福州宦溪野生蕉受到低溫脅迫時，特別是到了生長臨界溫度13℃時， KIN10s表達量增加，