鼓槌石斛的離體快繁及SPS基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、鼓槌石斛(Dendrobiun chrysotoxum Lindl)，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，又名金弓石斛。其花金黃色，氣味芳香，花期較長，具有良好的觀賞價(jià)值。同時(shí)，其莖內(nèi)含有多糖、毛蘭素、毛蘭菲及鼓槌菲等有效成分，具有較高的藥用價(jià)值。鼓槌石斛是兼具觀賞與藥用于一身的珍貴石斛種類之一，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。
　　隨著對鼓槌石斛保健價(jià)值認(rèn)識的提高和市場需求量的日趨增長，其野生資源

2、遭到嚴(yán)重破壞，種苗數(shù)量嚴(yán)重不足。為了保護(hù)現(xiàn)有的野生資源，滿足日益增長的市場需求，對鼓槌石斛進(jìn)行組培快繁技術(shù)研究迫在眉睫。另外，石斛的主要藥用成分之一多糖，因?yàn)槠渚哂姓{(diào)節(jié)免疫、降低血糖及抗腫瘤等功能，引起了眾多專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。但目前對石斛多糖的研究主要集中于對其多糖含量測定、結(jié)構(gòu)分析、多糖相關(guān)酶活性測定等生理生化方面，而有關(guān)克隆鼓槌石斛多糖代謝中的相關(guān)基因以及該基因的表達(dá)研究等分子生物學(xué)方面還未見報(bào)道。因此有必要采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段進(jìn)

3、行鼓槌石斛的研究。本試驗(yàn)以鼓槌石斛為材料，進(jìn)行離體快繁、蔗糖磷酸合成酶SPS基因克隆及其qRT-PCR分析研究，為鼓槌石斛苗木生產(chǎn)提供技術(shù)支持;并為研究石斛多糖合成機(jī)理、代謝路徑及培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)石斛新品種奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　1鼓槌石斛的離體快繁研究
　　首先，以鼓槌石斛種子為外植體，建立了無菌體系。將種子接入無菌萌發(fā)培養(yǎng)基1/4MS+0.5 mg·L-1KT+1.0g·L-1蛋白胨+150 g·L-1椰乳+15 g·L-

4、1糖+1.0g·L-1AC中，(PH=6.0)。30 d后可見種子全部萌發(fā)，萌發(fā)率100％。85 d后形成綠色無菌小苗，生長狀況較好，成功獲得無菌增殖材料。
　　其次，將初代培養(yǎng)85 d的無菌幼苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，通過正交試驗(yàn)比較培養(yǎng)基種類、NAA和6-BA濃度、香蕉泥濃度對無菌苗增殖的影響，篩選出適宜的增殖培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種因素對鼓槌石斛增殖效果的影響大小為:香蕉泥＞6-BA＞NAA＞基礎(chǔ)培養(yǎng)基;最佳增殖培養(yǎng)基為:MS+0.

5、5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA+50 g/L香蕉泥，增殖系數(shù)高達(dá)4.7，且幼苗長勢良好。之后以正交試驗(yàn)結(jié)果的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對增殖條件進(jìn)行了優(yōu)化處理。無菌苗增殖的優(yōu)化條件:糖濃度為30 g/L，有機(jī)添加物為香蕉泥，接種苗株高在2.5 cm左右，叢植芽數(shù)量為5株/叢時(shí)有利于提高增殖系數(shù)和促進(jìn)小苗的生長。
　　最后，以株高大于3 cm的試管苗為材料進(jìn)行生根研究，結(jié)果表明:選用NAA0.3 mg·L-1壯苗生根效果

6、最好，在木屑基質(zhì)中成活率100％。
　　2不同方法對鼓槌石斛根、莖、葉RNA的提取
　　本研究根據(jù)石斛中富含多糖、多酚類等次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，選擇Triozl試劑盒法、RNA prep Pure Plant Kit試劑盒法和CTAB法3種提取方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:CTAB法提取的總RNA條帶較清晰，OD260/OD280在2.0左右，RNA的濃度在200～600μg/μL之間，RNA純度較高，能夠滿足下一步試驗(yàn)需要。因此

7、，CTAB法是較理想的提取鼓槌石斛根、莖、葉RNA的方法。
　　3鼓槌石斛SPS基因片段的克隆
　　本研究成功克隆了鼓槌石斛SPS基因。經(jīng)過測序結(jié)果分析，其序列長度為2411bp，編碼803個(gè)氨基酸，與蘭科植物鐵皮石斛的SPS基因氨基酸序列的一致性最高，為97％，與其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于72％。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明該基因與單子葉植物在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。生物信息學(xué)分析表明，鼓槌石斛SPS基因編碼的蛋白屬

8、于親水性蛋白，有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別是蔗糖合成功能域及糖基轉(zhuǎn)移功能域。本試驗(yàn)首次克隆并報(bào)道了鼓槌石斛SPS基因。將該基因命名為Dendrobium chrysotoxum SPS，并在GenBank注冊，登錄號為:KP696500。
　　4鼓槌石斛EF-1α基因的克隆
　　本研究首次克隆了鼓槌石斛3個(gè)EF-1α基因片段，其序列長度均為620bp，均編碼206個(gè)氨基酸，將這些片段進(jìn)行Blast比較，結(jié)果顯示:3條序列與其他植物

9、的EF-1α基因核苷酸序列的同源性均在87％-89％之間，而氨基酸序列的同源性都在99％以上，通過對EF-1α基因序列的聚類分析發(fā)現(xiàn)，鼓槌石斛的3個(gè)EF-1α基因無論與單子葉植物還是雙子葉植物的EF-1α親緣關(guān)系都非常近，與單子葉植物油棕、蝴蝶蘭的一致性達(dá)100％，再次證明高等植物的EF-1α基因是一種高度保守的看家基因，為研究其他基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　5鼓槌石斛SPS基因的時(shí)空表達(dá)分析
　　本試驗(yàn)以成功克隆出的鼓槌石

10、斛EF-1α基因作為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR方法，對鼓槌石斛中不同生長年限的葉片、莖部及根中SPS基因的相對表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，SPS基因在鼓槌石斛的根、莖、葉中均有表達(dá)，而在不同組織之間的相對表達(dá)量因不同生長年限而有所差異。從總體來看，SPS基因在鼓槌石斛組織中的表達(dá)呈現(xiàn)莖＞葉＞根的趨勢，且不管是植株的葉還是莖，SPS在第二年的生長時(shí)期的相對表達(dá)量達(dá)到最高峰，之后隨著時(shí)間的推移有所下降，表明該基因可能在葉片蔗糖合成代謝過程