雞wdr72基因的離體克隆表達(dá)和體內(nèi)表達(dá)特征.pdf

1、wdr72是本文課題組篩選的蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的一個(gè)新基因,具體生化功能及生物學(xué)特性均未見(jiàn)報(bào)道。本文提取蛋雞子宮組織,克隆wdr72的全長(zhǎng)編碼基因;用原核載體對(duì)wdr72的C端（3'端）序列進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得重組蛋白、制得其多抗;此外,本文還利用qRT-PCR研究wdr72基因在蛋雞各個(gè)組織器官中,蛋殼形成過(guò)程中雞產(chǎn)道中的表達(dá)規(guī)律。
　　 1)克隆wdr72全長(zhǎng)編碼基因:提取蛋雞子宮組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄。參照GenBank中原雞（

2、Ggallus）wdr72基因序列,設(shè)計(jì)3對(duì)引物,(分別對(duì)應(yīng)1-970bp、877-2172bp、2111-2784bp)。從雞子宮cDNA中PCR克隆上述3個(gè)基因片段,測(cè)序正確后,連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1中,得到wdr72全長(zhǎng)基因.
　　 2)原核表達(dá)wdr72的C端（3'端）序列:將wdr72的C端（3'端）序列(1984-2784bp)構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b中,獲得wdr72的C端編碼基因的原核表達(dá)重組子

3、。經(jīng)過(guò)優(yōu)化,在37℃用0.4mMIPTG誘導(dǎo)得到了包涵體形式表達(dá)的產(chǎn)物。
　　 3)純化WDR72的C端（3'端）肽鏈:用8M尿素溶解后,將重組蛋白過(guò)鎳柱,然后用500mM咪唑梯度洗脫獲得大量較高純度的WDR72-C重組蛋白,并用其制作多克隆抗體。
　　 4)采集蛋雞的肝、心、脾、肺、胃、腸、腎、腦、胸肌以及輸卵管、白峽、子宮等產(chǎn)道組織。另外通過(guò)觀測(cè)蛋雞的蛋殼品質(zhì)及其產(chǎn)蛋規(guī)律,分別在蛋清形成階段、殼膜形成階段、初始礦化階

4、段、快速礦化階段、快速礦化后期采集產(chǎn)道組織。提取RNA后并反轉(zhuǎn)錄后,利用熒光定量PCR法比較分析wdr72基因的表達(dá)特點(diǎn),結(jié)果表明該基因主要表達(dá)在產(chǎn)道組織中,其中又以子宮組織最多,另外wdr72在殼膜形成階段及快速礦化階段有著活躍的表達(dá)。
　　 總之,本文克隆并構(gòu)建了wdr72全長(zhǎng)編碼基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒;表達(dá)并純化了WDR72-C端肽鏈序列,并制備了WDR72多抗;揭示了wdr72在蛋雞體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律及其與蛋殼形成的關(guān)聯(lián)性。