大鼠DJ-1基因的克隆和表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、帕金森(PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大常見(jiàn)神經(jīng)變性疾病。PD疾病的發(fā)生一般以散發(fā)型為特征,被認(rèn)為是基因易感性和例如暴露于毒性的外在因素的共同作用。其基因易感性也是單基因遺傳性基因缺陷的結(jié)果,目前已經(jīng)證實(shí)與十五種基因有關(guān):PART1~PART11以及DAT基因、TAU基因、Pitx3基因、CTSD基因。這些基因的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)研究PD疾病的新視角,但仍未獲得對(duì)這種疾病的有效治療措施。DJ-1是被發(fā)現(xiàn)與家族性PD有關(guān)的第三個(gè)基因,蛋白質(zhì)

2、印跡分析顯示DJ-1蛋白廣泛存在于肝臟、骨骼肌、腎臟、大腦和睪丸。其在細(xì)胞內(nèi)分布在細(xì)胞核、線粒體與胞漿,但主要在細(xì)胞漿中。在大腦組織,DJ-1蛋白在邊緣系統(tǒng)有大量表達(dá),這些區(qū)域包括尾狀核、丘腦和黑質(zhì)、海馬區(qū),這些區(qū)域與PD的關(guān)系最為密切。突變導(dǎo)致的DJ-1功能缺失可以誘發(fā)早發(fā)型PD,DJ-1的突變率比較低,大約1%。DJ-1蛋白在結(jié)構(gòu)上屬于Thij/PfPI家族,含有一個(gè)保守序列,這個(gè)家族的Thij結(jié)構(gòu)與GAT結(jié)構(gòu)域相關(guān),但卻有著不同的

3、功能。DJ-1蛋白有189個(gè)氨基酸,一般以二聚體形式存在。在DJ-1晶體中,兩個(gè)DJ-1單體有著廣泛連接,二者接觸面積覆蓋了整個(gè)分子表面的35%面積,其疏水基團(tuán)與功能有著密切的聯(lián)系。人與猴、大鼠、小鼠、雞的DJ-1同源性大約分別為98%、91%、91%、89%,本試驗(yàn)采用大鼠DJ-1作為研究。 本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行。第一部分為線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。通過(guò)建立正確的模型,成功進(jìn)行DJ-1基因的誘導(dǎo)表達(dá)。第二部分為大鼠D

4、J-1的克隆與表達(dá)。在建立模型誘導(dǎo)表達(dá)后,利用TRIZ0L法進(jìn)行RNA的提取,以DJ-1的信使RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增出DJ-1編碼基因。將該基因克隆入pGEM-TEasy載體,并進(jìn)行DNA序列分析。在此基礎(chǔ)上,將編碼DJ-1的基因片斷克隆至表達(dá)載體pQE30上,獲得重組表達(dá)載體pQE30/DJ-1(簡(jiǎn)稱為pQE30/DJ-1),經(jīng)測(cè)序證實(shí)重組入表達(dá)載體pQE30/DJ-1的DJ-1成熟肽編碼基因的序列與GenBank中所檢索

5、到的序列完全一致后,將表達(dá)載體pQE30/DJ-1轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109,進(jìn)行融合表達(dá)。表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后,DJ-1的表達(dá)量達(dá)到50mg/L培養(yǎng)基。目的蛋白含有6×His純化標(biāo)簽,可以經(jīng)金屬鰲合親和層析吸附于Ni-NTA樹(shù)脂層析柱,梯度增加沖洗液中咪唑濃度以去除非特異吸附的雜蛋白后,將目的蛋白洗脫,超濾離心法濃縮。經(jīng)SDS-PAGE、Westernblotting證實(shí)蛋白質(zhì)產(chǎn)物確實(shí)為融合蛋白DJ-1,且融合蛋白具有免疫原

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