癌基因DJ-1在人肝細胞癌中的作用及其機制研究.pdf

1、華中科技大學博士學位論文癌基因DJ-1在人肝細胞癌中的作用及其機制研究姓名：劉順芳申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（普外）指導教師：易繼林2011-04華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文 3第二部分 第二部分 DJ-1 在人肝癌細胞株的表達及其 在人肝癌細胞株的表達及其 shRNA 穩(wěn)定轉染 穩(wěn)定轉染 HepG2細胞系的建立 細胞系的建立 目的 目的: 檢測 DJ- 1 在人肝

2、癌細胞株的表達，構建針對 DJ- 1 的小發(fā)夾 RNA（small hairpin RNA, shRNA）真核表達載體，獲取干擾 DJ- 1 表達的質粒，轉染人肝癌 HepG2細胞，穩(wěn)篩后挑選亞克隆細胞系。 方法 方法: 在不同的人肝癌細胞株中，應用 Western Blot 及免疫細胞化學法檢測 DJ- 1的表達水平及細胞定位； 設計干擾 DJ- 1 表達的 shRNA 序列結構， 構建 RNA 干擾 （RNA interfer

3、ence ，RNAi）真核表達載體 pGenesil- 1.1 質粒，經過酶切、測序鑒定；干擾質粒經脂質體介導轉染人肝癌細胞 HepG2，經 G418 持續(xù)壓力選擇和有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉染的細胞系；利用半定量 RT- PCR 及 Western Blot 分別檢測篩選亞克隆細胞系的mRNA 和蛋白表達。 結果 結果: DJ- 1 在人肝癌細胞株：HepG2、MHCC- 97L、MHCC- 97H、SMMC- 7721 及Huh- 7

4、 中高表達，且不同肝癌細胞株中 DJ- 1 表達存在差異（P＜0.05） ，但在對照組人胚胎肝細胞 L02 中表達缺失。激光共聚焦顯示，DJ- 1 表達主要定位于肝癌細胞胞質；合成并構建 DJ- 1 shRNA 質粒載體， 雙酶切后電泳測序證實 DJ- 1 干擾序列及讀碼框完全正確；成功篩選穩(wěn)定轉染干擾質粒的 HepG2 亞克隆細胞系，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，半定量 RT- PCR 檢測顯示干擾質粒明顯抑制 DJ- 1 mRNA

5、表達，Western Blot檢測 DJ- 1 蛋白抑制率為 98.78%（P＜0.05）。 結論 結論: DJ- 1 在人肝癌細胞株胞質高表達，且其表達程度與肝癌細胞惡性生物學特性相關；成功構建 DJ- 1 shRNA 真核表達載體，建立干擾質粒穩(wěn)定轉染 HepG2 細胞系亞細胞克隆，為以 DJ- 1 基因為靶點的人肝癌基因治療的理論研究提供實驗基礎。 關鍵詞 關鍵詞: DJ- 1；RNA 干擾；肝細胞癌；生物學特性；腫瘤發(fā)生。