兔出血癥病毒衣殼蛋白缺失株的拯救及其復(fù)制特性的研究.pdf

1、兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)是一種具有強烈感染性和致死性的動物病毒，它屬于杯狀病毒科，兔病毒屬。深入研究RHDV致病機理對于更好地防控該病具有重要意義。衣殼蛋白是RHDV最重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白，它不僅決定了病毒的免疫原性，在侵染宿主，感染致病等方面也發(fā)揮重要的作用。迄今，關(guān)于衣殼蛋白與RHDV的侵染性和病毒的復(fù)制等之間的關(guān)系還不清楚。鑒于此，我們擬在前期研究基礎(chǔ)上，利用反向遺傳

2、學(xué)技術(shù)研究衣殼蛋白與RHD病毒的侵染性和病毒基因組復(fù)制等之間的關(guān)系。
　　 首先，我們在已建立的RHDV全長cDNA(PBLRHDV)的基礎(chǔ)上，利用定點突變技術(shù)，分別在5325nt和6393nt制造點突變，分別產(chǎn)生兩個NarⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點，然后使用NarⅠ消化PBLRHDV，再使用T4DNA連接酶重新連接，獲得刪除VP60大部分編碼區(qū)的重組突變體(PBLRHDVd5325-6931)，同時，還構(gòu)建了VP60完全缺失的RH

3、DV突變體(PBLRHDVdVp60)。通過體外轉(zhuǎn)錄，獲得RHDV突變體RNA，將之轉(zhuǎn)染RK13細(xì)胞，同時與完整病毒RNA進行對比。分別利用間接免疫熒光、RT-PCR和實時定量PCR等方法檢測衣殼蛋白缺失突變后，對病毒的侵染性和病毒基因組復(fù)制等方面的影響。
　　 研究表明，突變體RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，仍能拯救出病毒，且再次接種正常RK13細(xì)胞，仍能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE)，表明病毒缺失衣殼蛋白后仍具有侵染能力。應(yīng)用RT-PCR方法

4、分別檢測感染細(xì)胞中的正鏈和負(fù)鏈RNA，結(jié)果均擴增出目的基因，提示病毒突變體基因組在細(xì)胞中進行了復(fù)制。使用間接免疫熒光檢測RHDV的蛋白情況，結(jié)果表明在感染細(xì)胞中存在較多的特異熒光，證明在細(xì)胞中存在病毒蛋白的表達。此外，還用實時定量PCR方法對RHDV突變體基因組的復(fù)制情況進行了檢測，結(jié)果顯示用突變體(PBLRHDVd5325-6931)RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，第6h可以檢測到病毒基因組的復(fù)制，基因組拷貝數(shù)為4.66×108基因拷貝/mL，在第

5、24h，基因組的拷貝數(shù)達到峰值(1.11×109基因拷貝/mL)。類似地，PBLRHDV-dVp60突變體接種細(xì)胞后，第6h也可以檢測到病毒基因組的復(fù)制，基因組拷貝數(shù)為6.23×108基因拷貝/mL，在第24h，病毒基因組的拷貝數(shù)達到峰值（8.81×108基因拷貝/mL）。隨后2個突變體病毒基因組的拷貝數(shù)都逐漸降低，證明病毒缺失突變以后在細(xì)胞中可以正常復(fù)制，但是兩個突變體之間的復(fù)制水品平稍差別，相對pBLRHDV-d(5325-6931