兔出血癥病毒復(fù)制子的構(gòu)建及其衣殼蛋白基因遺傳變異分析.pdf

1、兔病毒性出血癥是由兔病毒性出血癥病毒(RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性和高度致死性傳染病，也是對養(yǎng)兔業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅的重要傳染病之一。國外研究表明，RHDV已呈現(xiàn)出變異趨勢，給RHD的防治帶來新的難題。為探討我國RHDV在過去20年間是否也出現(xiàn)了遺傳變異情況，以及其與國外分離株之間遺傳演化關(guān)系。本研究以核衣殼蛋白(Vp60)為靶基因，對浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物病毒研究室保存的1989～2006年間的8株RHDV進(jìn)行了序列測定，同時(shí)利用分子

2、生物學(xué)軟件，將其與國內(nèi)、外RHDV的Vp60進(jìn)行了序列比對和分析，并繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果表明，所有RHDV分離株的VP60基因均由1740個(gè)核苷酸組成，編碼580個(gè)氨基酸。它們與參考序列之間的氨基酸同源性為94.0％～99.8％。系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示，所選的RHDV分離株可分為2個(gè)基因群，每個(gè)基因群又可分別分為兩個(gè)亞群，其中中國分離株主要坐落于C亞群中，與歐洲分離株的遺傳距離比較近?；蛉褐g的遺傳距離有逐漸加大的趨勢，提示我國RH

3、DV在長期流行與演化過程中存在一定的遺傳變異趨勢。本研究結(jié)果對于制訂有效的RHD防治措施將有一定的參考意義。 由于RHDV是一種傳染性較強(qiáng)的Ⅱ類病原，在普通環(huán)境中操作和研究該病毒，存在較大的生物安全隱患。此外，RHDV是一種RNA病毒，要開展該病毒的基礎(chǔ)研究，必須具備一個(gè)便于在DNA水平操作的技術(shù)平臺，即反向遺傳操作系統(tǒng)。鑒于此，本研究在前期構(gòu)建RHDV侵染性克隆基礎(chǔ)上，應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)，分別在含有RHDV全基因組cDNA序列的

4、重組質(zhì)粒pBlRHDV的VP60基因兩端，引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)NarI，用．NarI酶消化刪除衣殼蛋白編碼區(qū)，保留了RHDV復(fù)制所必需的所有蛋白酶基因和兩端的非編碼區(qū)，成功構(gòu)建RHDV復(fù)制子。然后，將構(gòu)建好的RHDV復(fù)制子用NruI線性化，采用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-SP6系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果表明體外轉(zhuǎn)錄物RNA完整。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)錄

5、物RNA轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞，24h后可觀察到典型的RHDV致細(xì)胞病變效應(yīng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清提?。篟NA，RT-PCR方法檢測病毒基因組和病毒復(fù)制過程中的負(fù)鏈RNA，以及間接免疫熒光檢測復(fù)制子的表達(dá)，結(jié)果表明RHDV復(fù)制子在RK-13細(xì)胞中能夠正常表達(dá)和復(fù)制，此外還提示衣殼蛋白是RHDV維持侵染性所必需的結(jié)構(gòu)蛋白。本研究為在常規(guī)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中開展RHDV的應(yīng)用基礎(chǔ)提供了一個(gè)安全而有效的技術(shù)平臺，同時(shí)也為研究新型載體和新型基因工程疫苗奠定了物質(zhì)