兔出血癥病毒(RHDV)與兔出血癥病毒2型(RHDV2)的RT-PCR檢測(cè)方法研究.pdf

1、兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一種急性、高度致死性傳染病。RHD以呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主要病變特征，主要危害2月齡以上的養(yǎng)殖和野生的多個(gè)穴兔品種，死亡率達(dá)80％-100％。RHD于1984年被我國(guó)首次報(bào)道后，在世界很多國(guó)家出現(xiàn)發(fā)病和流行的報(bào)道，嚴(yán)

2、重威脅著世界養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織列為法定通過(guò)動(dòng)物疫病。2010年在法國(guó)出現(xiàn)了由RHDV新種即兔出血癥病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus2，RHDV2)引起的能感染致死30日齡以內(nèi)的兔子和傳統(tǒng)RHDV毒株滅活苗的免疫過(guò)的兔子的新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD)，也稱為兔病毒性出血癥2型(rabbit hemorrhagic d

3、isease type2，RHD2)。近年來(lái)RHD2已擴(kuò)散至意大利、西班牙、德國(guó)、葡萄牙、英國(guó)、挪威等多數(shù)西歐國(guó)家和亞速爾群島等國(guó)。我國(guó)目前尚無(wú)該病發(fā)生及其相關(guān)的研究報(bào)道，為此本研究在對(duì)RHDV2和RHDV基因序列分析基礎(chǔ)上對(duì)其RT-PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了初步研究，具體如下:
　　為建立用于兔出血癥病毒2型(RHDV2)的快速檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因，設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性引物和10條搭橋引

4、物，通過(guò)搭橋PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守區(qū)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并以其為模板，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和35份樣品檢測(cè)應(yīng)用，初步建立RHDV2 RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和構(gòu)建了pMD-19T-RHDV2重組質(zhì)粒以及pMD-19T-RHDV441，初步建立的RHDV2RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，RHDV2的檢測(cè)限度可達(dá)到230個(gè)拷貝的靶

5、基因片段，檢測(cè)RHDV、pGM-T-EBHSV（已構(gòu)建）、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌均無(wú)特異性擴(kuò)增。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示樣品中RHDV2核酸陰性。為建立用于兔出血癥病毒（RHDV）與兔出血癥病毒2型（RHDV2）鑒別診斷的檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因，在上面研究的基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，采用RT-PCR和搭橋PCR技術(shù)分別獲取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守區(qū)片段，構(gòu)建

6、重組質(zhì)粒pMD-19T-RHDV2、pMD-19T-RHDV441（上面已構(gòu)建）和pMD-19T-RHDV294，并以其為模板，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)，以及人工感染RHDV樣品和臨床樣品的應(yīng)用，對(duì)RHDV與RHDV2的復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示建立的RHDV與RHDV2復(fù)合RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可分別擴(kuò)增出RHDV和RHDV2的VP60保守區(qū)基因片段大小為294 bp和435

7、bp，RHDV與RHDV2的檢測(cè)限度分別為160和230個(gè)拷貝的靶基因片段，而pGM-T-EBHSV（已構(gòu)建）、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌等病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示人工感染樣品的RHDV檢出率為100％(5/5)，30份臨床檢樣RHDV和RHDV2檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　本研究為我國(guó)進(jìn)行RHDV2的防控提供了一種技術(shù)儲(chǔ)備和奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為RHDV和RHDV2的鑒別與流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)方法和科學(xué)參