牡丹試管苗生根誘導過程中蛋白質(zhì)表達變化的研究.pdf

1、本文以洛陽牡丹品種‘烏龍捧盛’的鱗芽為外植體進行培養(yǎng)獲得試管苗材料,初步建立了牡丹試管苗莖基部蛋白質(zhì)組雙向電泳技術體系,研究牡丹試管苗在生根誘導過程中的蛋白質(zhì)表達變化情況,尋找與生根相關的蛋白,從蛋白分子水平上研究不定根的發(fā)生機理,為解決牡丹試管苗生根難問題奠定理論基礎。本試驗的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.適合于牡丹試管苗莖基部的蛋白質(zhì)提取方法為三氯乙酸/丙酮沉淀法。分別以三氯乙酸/丙酮法、乙酸銨/甲醇酚提取法、乙醇/乙醚丙酮

2、法三種方法提取的蛋白,在相同的條件下進行雙向電泳。通過對雙向電泳圖譜的比較,并應用ImageMaster軟件進行分析,得出:用乙酸銨/甲醇酚提取法提取的蛋白質(zhì)所得2-DE圖譜的蛋白點很少,較模糊,且有明顯的拖尾現(xiàn)象,分辨率很低,在膠面上僅檢測到45個蛋白點；用乙醇/乙醚丙酮法提取的蛋白質(zhì)所得2-DE圖譜的蛋白點為101個,點數(shù)較少且模糊不清,分辨率低,橫豎紋干擾較大；而用三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白質(zhì)所得點數(shù)較多,可檢測到434個清晰的蛋

3、白點,且清晰圓潤,分布均勻,圖譜質(zhì)量較佳,適合后續(xù)分析。并且此法的重復性好,操作也較為簡便。
　　 2.牡丹試管苗莖基部蛋白質(zhì)的上樣量為1200μg時,雙向電泳效果較好。利用三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白樣品,選用長度為24cm、pH3-10的IPG膠條以及12％的PAGE分離膠,在其它條件一致的情況下,三個不同上樣量(800μg、1000μg、1200μg)的雙向電泳結(jié)果為:上樣量為800μg時,雙向電泳圖譜上蛋白點數(shù)較少且很模糊

4、,分辨率很低,只檢測到188個蛋白點:在上樣量為1000μg時,蛋白點數(shù)(273)雖有所增加,但蛋白點依然較為模糊,分辨率不高；上樣量為1200μg時,圖譜上的蛋白點數(shù)明顯增多,達到562個,蛋白點也比較清晰,分辨率較高,圖譜質(zhì)量明顯優(yōu)于其它兩者。
　　 3.牡丹試管苗生根誘導過程中各個時期的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果表明:牡丹試管苗莖基部的蛋白質(zhì)大部分屬于酸性蛋白。大部分蛋白點集中在酸性端,等電點(pI)主要在4—7范圍內(nèi),堿性端的蛋白質(zhì)

5、點較少。不同時期的蛋白質(zhì)2-DE圖譜有著很強的相似性,但也表現(xiàn)出一定的差異。在生根誘導前后和不同的誘導時期,蛋白質(zhì)在表達點數(shù)和表達量上都存在著差異。但差異表達明顯的蛋白質(zhì)點主要為表達量上的差別。隨著生根誘導培養(yǎng)時間的延長,表達量明顯上調(diào)的有3個蛋白點,下調(diào)表達明顯的為4個蛋白點,另有1個蛋白點在生根培養(yǎng)的第5d單獨表達。
　　 4.用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC/ESI/MS/MS)對所得的8個差異表達蛋白質(zhì)點進行肽序列信息鑒定,根