大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病Cdna-AFLP差異表達(dá)分析及分子遺傳圖譜的構(gòu)建.pdf

1、大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病是大白菜的一種生理性病害。近年來(lái)，其發(fā)生呈現(xiàn)越來(lái)越重的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重降低了大白菜的品質(zhì)和商品性，已成為制約大白菜出口的重要因素。針對(duì)引起黑芝麻斑點(diǎn)病發(fā)生的原因尚不完全清楚的問(wèn)題，本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)，分析抗感品系在發(fā)病條件（高氮）和不發(fā)病或少發(fā)病條件（低氮）下基因表達(dá)的差異，對(duì)相關(guān)差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析，為大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病的發(fā)病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。并通過(guò)構(gòu)建抗×感雜交一代的DH群體，利用AFLP技術(shù)構(gòu)建大白菜

2、分子遺傳圖譜，旨在為大白菜抗黑芝麻斑點(diǎn)病的遺傳育種和相關(guān)QTL定位提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)大白菜cDNA-AFLP技術(shù)體系的優(yōu)化
　　 采用大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病高抗品系‘C24’和高感品系‘(0)3B9’為材料，對(duì)cDNA-AFLP體系進(jìn)行優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果表明:試劑盒法提取的RNA較完整，純度較高;400ng的cDNA利用FastDigest(@) EcoRⅠ和FastDigest(@)MseⅠ進(jìn)行快速

3、雙酶切50min，酶切充分;在20μl的體系中，連接產(chǎn)物取原液作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板，并且預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)為35，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增結(jié)果最佳。
　　 (2)大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病相關(guān)基因cDNA-AFLP差異表達(dá)分析
　　 利用優(yōu)化后的cDNA-AFLP技術(shù)體系，采用64對(duì)引物對(duì)大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病進(jìn)行分析，篩選到19個(gè)與大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病相關(guān)的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄衍生片段(transcript-deri

4、ved fragments，TDFs)。結(jié)果表明:12個(gè)TDF與NCBI或Brassica Database已有序列同源，功能涉及激素調(diào)節(jié)、氧化還原酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分解、信號(hào)傳導(dǎo)等;3個(gè)TDF在NCBI或TIGR找到同源序列，但功能未知;有4個(gè)TDF未找到同源序列，可能是一些新基因。結(jié)合本課題組有關(guān)氮素濃度和形態(tài)對(duì)大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病影響的生理指標(biāo)的研究結(jié)果，推測(cè)大白菜黑芝麻斑點(diǎn)病可能是ACC、ABA的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)的降解，細(xì)胞膜上細(xì)胞