東南景天鋅超積累過程中基因表達(dá)差異的cDNA-AFLP分析.pdf

1、由于重金屬超積累植物在治理重金屬污染土壤方面，有廣闊的應(yīng)用前景，已引起國(guó)際土壤——植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)界和環(huán)境科學(xué)界的濃厚情趣和政府部門的高度重視。但目前對(duì)植物超積累重金屬機(jī)制認(rèn)識(shí)的不足限制了該技術(shù)的應(yīng)用和改良。東南景天(Sedum alfredii Hance)是在我國(guó)東南部地區(qū)一些古老的鉛鋅礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種新的鋅/鎘超積累植物，同時(shí)對(duì)鉛具有富集作用。本研究以超積累東南景天為材料，以其他近緣種為對(duì)照，分析了鉛鋅礦區(qū)東南景天在長(zhǎng)期的重金屬脅迫條件下

2、，進(jìn)化成超積累植物后的基因組變異情況；以及利用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)超積累生態(tài)型東南景天在鋅超積累過程中的基因表達(dá)差異進(jìn)行研究；另外還采用水培方法，觀察超積景天在鋅鎘積累過程中的GSH、H2O2、總硫含量隨鋅鎘積累量的變化，探討了GSH和H2O2在超積累過程中的作用，取得的主要研究結(jié)果如下： 1.植物長(zhǎng)期生長(zhǎng)在重金屬污染的生境中，逐漸進(jìn)化成不同的生態(tài)型，利用我國(guó)原生的Zn/Cd超積累生態(tài)型東南景天(Hyperaccumulat

3、ed ecotype;HE)為材料，以與其親緣關(guān)系較近的非超積累生態(tài)型東南景天(NHE)、圓葉景天(Sedum Makinoi Maxim：SMM)、凹葉景天(Sedum emarginatum Migo：SEM)、垂盆草(Sedum Sarmentoum Bunge：SSB)以及株芽景天(Sedum Bulbiferum Makino：SBM)為對(duì)照，利用RAPD方法，研究超積累生態(tài)型東南景天基因組變異的程度，并對(duì)部分超積累景天特有的

4、PCR條帶進(jìn)行測(cè)序，分析特異基因片段與超積累的關(guān)系。遺傳進(jìn)化樹分析表明：六種不同生態(tài)型的景天可以分成兩組，其中兩種東南景天為一組，另外四種為一組；超積累生態(tài)型和野生型東南景天有著相似的遺傳背景，相似系數(shù)顯示變異程度已超過種的界限。說明污染土壤對(duì)植物的進(jìn)化有著非常大的影響：部分超積累景天特異PCR片段測(cè)序表明，ATP-硫酰化酶(ATP sulfuryase)、脫水調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白及一些未知基因片段可能與超積累性狀有一定的關(guān)系。 2.植

5、物對(duì)重金屬鋅／鎘超積累與過氧化氫產(chǎn)生關(guān)系的研究表明，在1000uM Zn2+或200uM Cd2+處理?xiàng)l件下，超積累生態(tài)型東南景天地上部Zn2+的積累量高于Cd2+的積累量。地上部Zn2+/Cd2+積累時(shí)間動(dòng)力學(xué)顯示在前15天，呈線形增加，隨后積累速度下降。同樣，地上部總硫、GSH以及H2O2的含量也是在前15天迅速增加，后10天逐漸下降?？偭蚝虶SH的含量都是Cd2+處理下較Zn2+處理的高，而H2O2的含量則是Cd2+處理下較Zn2

6、+處理的低；地上部zn2+含量變化與地上部GSH、總硫及H2O2變化趨勢(shì)相似，而Cd2+則是在第5天時(shí)含量就達(dá)到最大，以后開始逐漸下降。以上結(jié)果推測(cè)：含硫有機(jī)物可能不是超積累生態(tài)型東南景天Zn2+/Cd2+積累的主要配體，GSH的功能主要是解除體內(nèi)游離態(tài)Zn2+/Cd2+的毒性，H2O2很可能是與超積累相關(guān)的一種信號(hào)分子。增加硫元素的供應(yīng)對(duì)提高Zn2+/Cd2+的積累有一定的作用；東南景天對(duì)Zn2+和Cd2的吸收和積累存在不同的調(diào)控機(jī)制

7、。 3.為方便比較鋅超積累生態(tài)型東南景天在不同條件下的基因表達(dá)差異，需要克隆一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的基因作為對(duì)照。在本試驗(yàn)中，利用設(shè)計(jì)的兼并引物通過PCR方法獲得了一段actin基因的序列，然后根據(jù)獲得的序列再通過3'-RACE和5'-RACE方法，得到了全長(zhǎng)的actin基因序列；克隆得到的actin基因全長(zhǎng)為1418bp，預(yù)測(cè)的編碼區(qū)域?yàn)?131bp，編碼377個(gè)氨基酸。 4利用cDNA-AFLP(cDNA擴(kuò)增長(zhǎng)度片段多態(tài)性：c

8、DNA-amplified fragment length polymorphism)方法，研究了我國(guó)原生的東南景開在鋅超積累過程中的基因表達(dá)差異。結(jié)果表明：隨著處理時(shí)間的增加，地上部鋅含量也呈逐漸增加趨勢(shì)；在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的多態(tài)性電泳圖中，共出現(xiàn)4000多個(gè)條帶，其中約有100個(gè)左右的轉(zhuǎn)錄差異片段(TDFs：transcript-derived fragments)，并成功克隆了87個(gè)TDFs。；經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，其中有47個(gè)與己知或假定

9、的基因存著明顯的同源性，6個(gè)與未知功能的基因有同源性，34個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的基因沒有明顯的相似性。隨機(jī)地從87個(gè)克隆片段中的選取23個(gè)做Real-time PCR驗(yàn)證，有16個(gè)表達(dá)譜與cDNA-AFLP完全相同；在38個(gè)與現(xiàn)有已知功能基因相似的片段中，按照功能可分成轉(zhuǎn)錄因子、脅迫響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄促進(jìn)、細(xì)胞和組織代謝、光合作用、表達(dá)調(diào)節(jié)以及混合功能等幾類： 34個(gè)沒有同源性的和15個(gè)與未知功能基因(假定的基因和未知功能的基因)同源的加在一起共有