cdna-aflp詳細(xì)步驟

1、3.2.3雙鏈cDNA的合成及精制(1).第一鏈cDNA的合成采用TaKaRa公司一鏈合成試劑盒進(jìn)行，具體操作如下：在PCR管中加入下列反應(yīng)成分：總RNA約5μg，Oligo(dT)18（50μmolL）1μL，dNTP（10mmolL）1μL，DEPCH2O補(bǔ)足10μL。于65℃變性5min，置于冰上2min。向上述PCR管中繼續(xù)加入下列成分：5RTBuffer4μL，RNaseInhibit（40UμL）0.5μL，MMμLVRev

2、erseTranase（5UμL）1μL，ddH2O4.5μL，總體積20μL，混勻稍離心，42℃溫浴1h，70℃15min使酶失活，直接進(jìn)行第二鏈合成。42℃恒溫1h，70℃水浴10min，然后置于4℃冷卻。然后進(jìn)入第二鏈的合成(2).第二鏈cDNA的合成使用DNApolymeraseⅠ（TaKaRa，大連）和RNaseH（TaKaRa，大連）進(jìn)行，體系如下:ComponentvolumecDNA第一鏈10.0μL反應(yīng)buffer14

3、.0μLdNTP(10mM)1.5μLDNAPolymerseⅠ（4UμL）3.5μLRNaseH（10UμL）0.2μLDNA連接酶(350uμL)0.3μLddH2O10.5μLFinalvolume40.0μL輕輕混合，稍離心，PCR儀上16℃反應(yīng)2.5h，70℃終止反應(yīng)10min。加入0.4μLT4DNA聚合酶，輕輕混合，PCR儀上37℃反應(yīng)10min。加入5μL200mmolLEDTA終止反應(yīng)。(3).雙鏈cDNA的精制向第二

4、鏈合成產(chǎn)物中加入50μL的苯酚氯仿異戊醇（25:24:1）溶液，劇烈混勻，室溫12000rmin，離心10min。將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入100μL預(yù)冷（20℃）的異丙醇，20℃放置2h以上。4℃，12000rmin，離心15min，棄上清，沉淀用沉淀用75％的乙醇（4℃放置）洗兩次。沉淀風(fēng)干510min，加入10－20μL的ddH2O溶解。用1.5％的瓊脂糖快速電泳檢測(cè)，并測(cè)定OD值。20℃保存?zhèn)溆谩?13.2.4cDNAAFLP

5、差異顯示Componentvolume20稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL10PCRbuffer2.0μLMg2(25mM)2.0μLdNTP(10mM)0.5μL選擴(kuò)引物A（20μM）1.0μL選擴(kuò)引物T（20μM）1.0μLTaqDNAPolymerase(5UμL)0.2μLddH2O11.3μLFinalvolume20.0μL混勻，稍離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃2min；94℃30s，65℃（每循環(huán)降低0.7℃）30s

6、，72℃60s，共12個(gè)循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃1min共23個(gè)循環(huán)；72℃10min。。共用16個(gè)A引物和16個(gè)T引物，組成256對(duì)引物組合對(duì)所有材料分別進(jìn)行cDNAAFLP差異顯示分析。3.2.4.5聚丙烯凝膠電泳分析電泳分析采用20cm20cm的豎直板電泳槽進(jìn)行。非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度6.0%，電泳液為1TBE。電泳參數(shù)：恒壓280V。上樣量4.0μL，分子量marker稀釋3后上樣2.0μL。電泳完畢，剝膠，進(jìn)

7、行銀染分析，具體操作如下：(1).將凝膠于300mL固定液（2％乙酸，0.1%冰乙酸）中固定10min；(2).在0.2%的硝酸銀滲透液中滲透30s；(3).蒸餾水漂洗30s；(4).0.002%的硫代硫酸鈉水溶液中漂洗30s；(5).在顯色液（1.5%NaOH，0.4％甲醛）中顯色至條帶清晰；(6).自來(lái)水沖洗照相，以做分析。3.2.4.6差異片段的聚丙烯酰胺凝膠回收與再擴(kuò)增在差異條帶的對(duì)應(yīng)位置用干凈的刀片切取條帶置離心管中，加100